一种抗猫CD44多克隆抗体及其制备方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种抗猫CD44多克隆抗体及其制备方法与应用。所述多克隆抗体在制备过程中所用的抗原多肽序列如SEQ ID NO.1所示。所述多克隆抗体的制备方法如下：（1）合成多肽与KLH载体蛋白交联；（2）制备兔抗猫CD44多肽抗体；（3）收集、分离得到含有抗体的血清，纯化抗体，即得到兔抗猫CD44多肽的抗体；（4）ELISA与Western blot鉴定。本发明专利技术制备的抗猫CD44多克隆抗体效价高、亲和力强，能够实现猫组织样本中CD44的定性、定量检测，可用于相关疾病的检测与诊断，为相关疾病的研究与治疗奠定重要的基础。基础。

【技术实现步骤摘要】
一种抗猫CD44多克隆抗体及其制备方法与应用


[0001]本专利技术涉及生物化学和分子免疫学领域，特别涉及一种抗猫CD44多克隆抗体及其制备方法与应用。

技术介绍

[0002]CD44是非激酶、I 型跨膜糖蛋白，在胚胎干细胞上表达，并在结缔组织和骨髓等其他细胞类型上以不同水平表达。CD44与透明质酸（HA，由基质细胞和癌细胞表达，细胞外基质主要成分）结合，介导细胞增殖、粘附、迁移和侵袭。
[0003]在某些感染、自身免疫性疾病等炎症疾病时，细胞毒性 T 淋巴细胞、自然杀伤细胞等细胞表面高表达CD44，其与HA的作用使内皮细胞破损，从而导致多种临床疾病。此外，CD44是一个公认的肿瘤干细胞膜表面标志物，是上皮细胞间充质转化的关键调节因子，参与肿瘤的启动，进展，转移等。
[0004]目前对宠物的疾病检测手段以及相关研究并未完善，因此，制备抗猫CD44蛋白的多克隆抗体对于评价猫体内的炎症和癌症状态以及了解疾病的进展具有重要意义。

技术实现思路

[0005]为解决现有技术中针对猫CD44蛋白缺少特异性抗体的问题，本专利技术提供了一种抗猫CD44多克隆抗体及其制备方法与应用。
[0006]本专利技术通过以下技术方案得以实现：
[0007]本专利技术公开了一种猫CD44蛋白多肽，序列如SEQ ID NO.1所示。
[0008]本专利技术进一步公开了一种抗猫CD44多克隆抗体。
[0009]本专利技术进一步公开了抗猫CD44多克隆抗体制备方法，包括以下步骤：
[0010]将上述经修饰、与KLH蛋白偶联后的CD44蛋白多肽乳化后在兔背部皮下注射，初次免疫后，进行3次加强免疫；
[0011]收集、分离得到含有兔抗猫CD44多克隆抗体的血清；
[0012]采用Protein G纯化柱法对制备的抗猫CD44多克隆抗体进行纯化；
[0013]对抗猫CD44多克隆抗体进行效价检测；
[0014]通过Western Blot对抗猫CD44多克隆抗体的灵敏度和特异性进行鉴定。
[0015]本专利技术还提供了抗猫CD44多克隆抗体在相关疾病和研究中检测猫CD44的应用。
[0016]优选的，抗猫CD44多克隆抗体在Western Blot及其他免疫学相关检测的应用。
附图说明
[0017]图1为应用本专利技术抗猫CD44多克隆抗体检测猫脾脏中CD44表达水平的Western Blot检测结果图，条带清晰，图中免疫印迹的目的条带大小在75 kDa
‑
100 kDa之间的条带，与猫CD44蛋白的理论分子量（89 kDa）大小一致。
实施方式
[0018]实施例1：实验动物的免疫
[0019]选取2只适龄的新西兰雄兔作为免疫动物，首次免疫时，将500 uL的偶联蛋白与500 uL的弗氏完全佐剂混匀，用注射乳化器乳化后经背部皮下多点注射进行免疫。2周后，进行首次加强免疫，将500 uL的偶联蛋白与500 uL的弗氏不完全佐剂混匀，用注射乳化器乳化后经背部皮下多点注射进行免疫。此后每隔2周进行同样操作的加强免疫，前后共3次。在最后一次加强免疫的一周后采用颈动脉放血的方式收集兔子血液，制备血清。
[0020]实施例2：亲和层析柱纯化抗体
[0021] 采用Protein G纯化柱法对制备的多克隆抗体进行纯化。裸肽与琼脂凝胶偶联后用binding buffer闭24h；1 M NaCl清洗10个柱体积后用PBS（pH=7.4）清洗5个柱体积，将血清加入柱中，重复6次；PBS清洗后用elution buffer洗脱；用1 M Tris(pH=9.0)将蛋白pH调至7；10000rpm，10 min离心后收集上清，用30 kDa超滤管浓缩，用PBS置换并调整抗体浓度至2 mg/mL。加BSA(1%)，甘油(50%)，Proclin 300(0.1%)，使抗体终浓度为1 mg/mL。纯化后的抗体保存
‑
80℃冰箱中。
[0022]实施例3：间接ELISA法测定抗体的效价
[0023]将CD44与KLH偶联蛋白包被ELISA板，4℃下包被过夜；次日甩掉板中液体，在吸水纸上拍干板子，用2% BSA室温（25℃）封闭2h，用抗猫CD44多克隆抗体作不同浓度稀释，PBST洗板，1:1000、1:2000、1:4000、1:8000、1:16000、1:32000、1:64000、1:128000，空白孔取未经免疫的兔血清做对照，37℃，1h；洗板后加入辣根过氧化酶标记的羊抗兔的二抗，37℃孵育1h。洗板后加入TMB进行显色反应，硫酸终止反应后测定450nm波长的吸光度。新西兰兔抗血清效价在1:64000以上，效价检测结果如表1所示：
[0024]表1抗猫CD44多克隆抗血清的效价（2次重复）
[0025]抗体稀释倍数抗体效价抗体效价1:10002.27632.29531:20002.12361.92721:40001.75071.74711:80001.13661.47321:160000.83940.9891:320000.56430.66011:640000.4320.39561:1280000.24970.2458空白0.04080.0418
[0026]实施例4：Western Blot分析抗猫CD44多克隆抗体的特异性
[0027]按照标准方法配制SDS
‑
PAGE凝胶，将8 μL蛋白浓度为10 mg/mL的组织裂解液加入垂直电泳槽的上样孔中，恒压80V电泳，待样本跑过浓缩胶，换成恒压120V，电泳至溴酚蓝指示剂跑至分离胶底部时终止电泳，采用湿转膜方法恒压90V电转80分钟，将蛋白转膜至NC膜。将实例2中获得的抗猫CD44多克隆抗体作为一抗，1：1000稀释，4℃震荡过夜，然后用HRP标记的羊抗兔抗体在室温下震荡2小时，采用特超敏ECL化学发光试剂盒（碧云天）显色，曝光87s，得到免疫印迹结果。结果如图1，本专利技术中的抗猫CD44多克隆抗体灵敏度高，条带清
晰，可在猫脾脏组织裂解液中检测到分子量75 kDa
ꢀ‑
100 kDa之间的条带，与猫CD44蛋白预期相对分子量相符。
[0028]以上所述仅是本专利技术的优选实施方式，仅用于解释本专利技术，而不用于限制本专利技术的范围，在不脱离本专利技术技术方案和原理的前提下，对本专利技术所作的本领域普通技术人员容易实现的任何改动都将落入本专利技术的权利要求范围之内。
本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种猫CD44多肽，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。2.一种如权利要求1所述猫CD44多肽的多克隆抗体，其特征在于，将猫CD44多肽与KLH载体蛋白交联形成的复合蛋白作为免疫原，通过免疫动物制备。3.一种如权利要求2所述抗猫CD44多克隆抗体的制备方法，其特征在于，通过权利要求1和2所述的猫CD44多肽复合蛋白免疫动物，收集动物抗血清，从抗血清中分离...

【专利技术属性】
技术研发人员：姚婷，仇雅婷，沈丽雅，
申请(专利权)人：卫仕宠物营养研究院芜湖有限公司，
类型：发明
国别省市：