一种京巴犬口腔肿瘤细胞系及其构建方法技术

本发明专利技术公开了一种京巴犬口腔肿瘤细胞系及其构建方法。通过离体的犬口腔肿瘤组织的原代培养，成功构建了京巴犬口腔肿瘤细胞系并冻存，将其命名为PETCC#143，其保藏编号为CGMCC NO:45542。本发明专利技术所述的京巴犬口腔肿瘤细胞系呈贴壁状态，胞体梭形或不规则三角形，中有卵圆形核，胞质向外伸出2

【技术实现步骤摘要】
一种京巴犬口腔肿瘤细胞系及其构建方法


[0001]本专利技术涉及生物
，更具体地说，涉及一种京巴犬口腔肿瘤细胞系及其构建方法。

技术介绍

[0002]近年来，肿瘤在犬（Canis lupus familiaris）中的发生率日益增高，而其中口腔肿瘤的发生比率在犬约占所有肿瘤的6%，犬恶性口腔肿瘤占犬肿瘤的5.3%。口腔是犬猫临床第四大肿瘤易发部位，易早期侵犯临近重要器官，如眼、颅底、颈部等。口腔肿瘤常给患犬带来痛苦，患犬表现出进食困难、口周疼痛、牙齿松动、口腔异味、流涎，继而导致体重丢失，严重者会发生持续性或周期性的口腔出血，有时肿瘤占位较大，可见面部不对称，以及咬合不正等等。犬口腔肿瘤中最常见的有恶性黑色素瘤、纤维肉瘤以及鳞状细胞癌。目前，犬的口腔肿瘤治疗一般预后差，肿瘤易发生转移，平均术后存活寿命为1年左右。故此，一种京巴犬（Pekingese）口腔肿瘤细胞系的建立对于犬的口腔肿瘤研究具有十分重要的意义。

技术实现思路

[0003]本专利技术的目的在于提供一种京巴犬口腔肿瘤细胞系，命名为PETCC#143，该细胞系已于2023年4月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101，其保藏编号为CGMCC NO:45542，该细胞系可在体外连续传代培养而保持遗传稳定性。
[0004]本专利技术所提供的京巴犬口腔肿瘤细胞系来源于14岁的绝育后的雌性京巴犬口腔肿瘤组织。
[0005]本专利技术提供上述可以稳定遗传的京巴犬口腔肿瘤细胞系的构建方法，包括：
[0006]获取京巴犬口腔肿瘤组织；将肿瘤组织放在6孔板中，将肿瘤组织用组织匀浆器打碎至肉糜状；取肉糜置于离心管中，加入消化液轻柔颠倒混匀；置于摇床中振荡消化；将红细胞裂解；收获细胞悬液并接种；传代；冻存。
[0007]进一步，所述获取京巴犬口腔肿瘤组织包括手术取下京巴犬的口腔肿瘤组织，用含双抗的PBS浸没后转移至生物安全柜。
[0008]进一步，所述将肿瘤组织放在6孔板中，将肿瘤组织用组织匀浆器打碎至肉糜状包括将肿瘤组织放在6孔板中，重复用干净的PBS浸洗5次，用组织匀浆器将肿瘤组织打碎至肉糜状，用少许PBS浸润。
[0009]进一步，所述取肉糜置于离心管中，加入消化液轻柔颠倒混匀包括用移液枪配合剪过的1ml枪头将组织肉糜吸取转移至15ml离心管中，按250：1的比例加入胶原酶IV，轻柔颠倒离心管混匀。
[0010]进一步，所述置于摇床中30min振荡消化包括将含组织肉糜的离心管封好，放入摇床中，200rpm，37℃条件下振荡消化30min。
[0011]进一步，所述将红细胞裂解包括以下步骤：
[0012]步骤一：取出离心管后，在生物安全柜中用40um筛网过滤至50ml离心管；
[0013]步骤二：将离心管放至离心机中，2000rpm，4℃离心5min；
[0014]步骤三：弃上清，用5mlACK重悬细胞，静置1min；
[0015]步骤四：将离心管放至离心机中，1800rpm，4℃离心5min。
[0016]进一步，收获细胞悬液并接种包括以下步骤：
[0017]步骤一：将离心管转移至生物安全柜，弃上清，用大量PBS重悬沉淀；
[0018]步骤二：将悬液用40um筛网过滤至50ml离心管中；
[0019]步骤三：将离心管放至离心机中，1000rpm，25℃离心5min；
[0020]步骤四：将离心管转移至生物安全柜，弃上清，视沉淀量用适量培养液重悬后接种至6孔板或6cm皿中，放至37℃，5%CO2的饱和湿度的恒温培养箱中培养。
[0021]进一步，所述传代包括以下步骤：
[0022]步骤一：取附着细胞的细胞培养皿，置于生物安全柜中，吸取上清；
[0023]步骤二：用1ml PBS缓冲液淋洗表面，加入1ml胰酶在37℃条件下消化贴壁细胞，显微镜下观察，2分钟后大部分细胞飘起恢复圆形，收集细胞悬液于15ml离心管中，用2ml含血清培养液终止消化；
[0024]步骤三：将离心管放至离心机中，常温1000rpm离心5分钟，弃上清，按照1:2的比例接种到两个6孔板或6cm皿中。
[0025]进一步，所述冻存包括当细胞传代10次以上细胞状态仍良好时，消化后用培养液：DMSO=9：1的冻存液重悬并按每管1
×
106个/ml的密度冻存处理。
[0026]优选的，上述所用的培养液（传代3次之前）为基础DMEM培养基，10%胎牛血清，1%100
×
谷氨酰胺，1%100
×
青霉素
‑
链霉素溶液（双抗），1
‰
1000
×
支原体清除试剂，培养液（传代3次之后）为基础DMEM培养基，10%胎牛血清，1%100
×
谷氨酰胺，1%100
×
青霉素
‑
链霉素溶液（双抗）。
[0027]与现有技术相比，本专利技术的优点在于：
[0028]本专利技术所述实验方法简单易行，所提取的肿瘤细胞系遗传稳定，增殖迅速，2
‑
3天即可传代，生长密度要求低，易于消化和传代，具备典型的细胞模型特点，适用于探索犬口腔肿瘤治疗尤其是化疗、放疗等方式和方法。
附图说明
[0029]图1为显微镜下（100X）体外长期培养的细胞形态示意图。
实施方式
[0030]实施例1.取材及细胞培养
[0031]1）组织块是2022年10月27日从一只绝育后的14岁雌性京巴犬的口腔肿瘤病灶部位切取获得的，切下3.0cm*2.5cm组织后，放入PBS缓冲液中浸没，转移至生物安全柜。
[0032]2）在生物安全柜中用含5%双抗的PBS缓冲溶液漂洗3次，之后用无菌的手术剪去除上面的结缔组织后将组织块剪碎成1mm3的小碎块，将其收集至15ml离心管中，按250：1的比例加入IV型胶原酶，混匀后放入预热好的37℃摇床中以200rpm速度振荡30分钟。将无菌40um细胞筛放至50ml离心管上，用1ml PBS缓冲液充分润洗，将组织倒入细胞筛中，用无菌
1ml注射器的推柄研磨15分钟，使研磨充分。将沥过的悬液放入预冷的4℃离心机中，2000rpm离心5分钟，弃上清，用适量红细胞裂解液重悬沉淀，静置1分钟，待红细胞裂解后放入预冷的4℃离心机中，1800rpm离心5分钟，弃上清，用大量PBS缓冲液重悬沉淀，将无菌细胞筛放至另一个50ml离心管上，用1ml PBS缓冲液充分润洗，将悬液再次过筛后放入常温离心机，1000rpm离心5分钟，弃上清，用培养液重悬沉淀并接种在6孔板或6cm细胞培养皿中，放入37℃，5% CO2，饱和湿度的培养箱中静置培养。
[0033]3）24小时后观察，已有细胞贴壁，待细胞密度达到85%即可进行传代。
[0034]4）传代时取附着细胞的细胞培养皿，置于本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种京巴犬口腔肿瘤细胞系PETCC#143，其特征在于，所述京巴犬口腔肿瘤细胞系保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，其保藏编号为CGMCC...

【专利技术属性】
技术研发人员：张文娟，白迦南，张玥，
申请(专利权)人：卫仕宠物营养研究院芜湖有限公司，
类型：发明
国别省市：