一种保留免疫细胞的结肠癌类器官构建方法技术

本发明专利技术提供了一种保留免疫细胞的结肠癌类器官构建方法，包括以下步骤：新鲜结肠癌组织的清洗和机械性切碎；切碎的组织块置于用离心管中，离心去除上清并用专用培养基重悬组织获得组织块悬液；向transwell小室的底部加入专用基质，放置于细胞培养箱待基质凝固；将组织块悬液与解冻的基质胶混合，接种于transwell小室底部凝固的基质上层；待基质胶凝固后，在transwell小室下层加入专用培养基。本发明专利技术还提供了通过所述方法获得的结肠癌类器官在结直肠癌小鼠模型构建、结直肠机理研究、药物筛选、疗法评估中的应用。疗法评估中的应用。疗法评估中的应用。

【技术实现步骤摘要】
一种保留免疫细胞的结肠癌类器官构建方法


[0001]本专利技术涉及生物医药领域，特别涉及一种保留免疫细胞的结肠癌类器官构建方法。

技术介绍

[0002]结直肠癌是全球第四大最常见的癌症，也是死亡率第三高的癌症类型。结直肠癌具有很强的肿瘤异质性，包含多种不同的基因类型和表观遗传突变，因此针对不同类型的结直肠癌的治疗方式也不尽相同。目前，结直肠癌的治疗方式以手术、放疗、化疗为主，辅以靶向治疗和免疫治疗，但根据肿瘤生物特征以及发展阶段的不同在治疗方法的选择以及不同方案的联用方面也展现出很大的不同。面对种类繁多的治疗方法，如何针对不同患者的特征实施个性化的精准治疗是一个十分关键的问题。
[0003]为了实现肿瘤的个性化精准治疗，科学家们使用多种临床前模型来模拟特定治疗方法在患者体内的真实疗效。其中最经济和常用的是肿瘤细胞的二维培养模型。该模型是将肿瘤细胞系或肿瘤原代细胞培养于细胞培养皿之中，在细胞培养基中加入不同的化疗及靶向治疗药物或对细胞进行射线的辐照，观察细胞的形态及活力变化从而判断肿瘤对特定治疗或治疗组合的反应。但这种二维培养体系存在诸多弊端，首先，培养皿中的细胞形成的是单层的二维结构，而在体内细胞的分布是具有极性的，细胞组成了一个特定的结构，不同细胞在结构的不同位置中功能也不尽相同，因此，二维细胞中观察到的现象可能无法反应患者体内肿瘤对不同治疗的真实反映。此外，体内的肿瘤是由多种细胞构成的，是多克隆组织，具有肿瘤异质性，但肿瘤细胞系是单克隆来源的，无法还原肿瘤组织的复杂性，因此对不同疗效的预测价值也十分有限。
[0004]小鼠移植瘤模型在肿瘤研究中的应用也十分广泛，与细胞系相比，移植瘤模型可以很好地保留原始肿瘤的结构、细胞组成、分子生物学特征和原始肿瘤的复杂性，但此模型费用较高，培养周期长且培养的成功率较低，因此也不适合用于指导临床个体化用药和高通量的药物敏感性筛选。类器官是将具有干性潜能的细胞进行3D培养，从而形成与原有器官/组织类似的器官/组织。肿瘤类器官(patient
‑
derived organoids,PDO)是通过对肿瘤组织进行三位培养得到的保留原始肿瘤多项特征的多细胞团。经研究证实，包括结直肠癌在内的多种肿瘤类型的PDO在基因组、转录组以及免疫组化染色特点等多方面浓缩了原始肿瘤的特征，即二者在多组学层面上具有很高的重合度。在功能学方面，也有多项研究证明PDO与原始肿瘤组织具有高度一致的药敏特性。此外，PDO的增殖速度快、培养周期短、培养成功率较高、实施性和可操作性较强，这使PDO成为了在细胞系和人源化小鼠模型之后另一个癌症精准治疗和新药研发领域的热点模型。
[0005]传统的类器官模型虽然具有诸多优势，但其不包含免疫细胞在内的肿瘤微环境成分，因此其应用受到了一定的限制，无法进行肿瘤免疫治疗相关的研究。

技术实现思路

[0006]针对以上技术问题，本专利技术提供了一种可实现免疫细胞保留的结直肠癌组织类器官培养方法，使得肿瘤组织中的免疫细胞在类器官中得到保留，从而进一步拓宽类器官的应用范围并服务于肿瘤免疫微环境及肿瘤免疫治疗相关的研究。具体地，
[0007]本专利技术第一方面提供了一种保留免疫细胞的结肠癌类器官构建方法，包括以下步骤：
[0008]A1)新鲜结肠癌组织的清洗和机械性切碎；
[0009]A2)切碎的组织块置于用离心管中，离心去除上清并用专用培养基重悬组织获得组织块悬液；
[0010]A3)向transwell小室的底部加入专用基质，放置于细胞培养箱待基质凝固；
[0011]A4)将组织块悬液与解冻的基质胶混合，接种于transwell小室底部凝固的基质上层；
[0012]A5)待基质胶凝固后，在transwell小室下层加入专用培养基。
[0013]在某些实施方式中，所述步骤A1)中清洗所用溶液为含青霉素/链霉素的PBS；优选地，所述青霉素/链霉素的浓度为2％。
[0014]在某些实施方式中，所述步骤A2)中所述切碎的组织块直径为0.5
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2mm；优选地，组织块直径为0.6
‑
1.2mm。
[0015]在某些实施方式中，所述步骤A2)中离心的转速为500g/min，离心时间为5min，其中升速和降速均为9。
[0016]在某些实施方式中，所述步骤A2)和A5)中的所述专用培养基组分包括：DMED/F12培养基、R
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spondin1蛋白、表皮细胞生长因子、前列腺素E
‑
2、白细胞介素
‑
2。
[0017]在某些实施方式中，所述步骤A2)和A5)中所述专用培养基包括DMED/F12培养基、R
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spondin1蛋白、Noggin、表皮细胞生长因子、HEPES、Glutamax、Normocin、Gentamicin/amphoteritin、N2、B27、n
‑
Acetylcysteine、SB202190、Gastrin、前列腺素E
‑
2、白细胞介素
‑
2。
[0018]在某些实施方式中，所述步骤A3)中所述transwell小室直径为12mm，PET膜，孔径04.um。
[0019]在某些实施方式中，所述步骤A3)中所述专用基质包括：Matrigel、DMEM培养基、PBS；优选地，所述Matrigel含量为70％
‑
90％，DMEM培养基含量为5％
‑
15％，PBS含量为5％
‑
15％。
[0020]在某些实施方式中，所述步骤A3)中所述专用基质的凝固时间为20
‑
40min；进一步优选地，专用基质的凝固时间为25
‑
35min。
[0021]在某些实施方式中，所述步骤A4)中所述基质胶优选为Matrigel。
[0022]本专利技术第二方面提供了根据本专利技术第一方面所述的构建方法获得的结肠癌类器官在结直肠癌小鼠模型构建、结直肠机理研究、药物筛选、疗法评估中的应用。
[0023]与现有技术相比，本专利技术的有益效果在于：
[0024]本专利技术提供的保留免疫细胞的结直肠癌类器官构建方法不同于现有的结直肠癌类器官培养方法，在此方法中，首先类器官的上层暴露于空气中，下层浸润在培养基中，既保证的类器官的营养供给同时增加了培养体系的含氧量，因此相对于传统的类器官培养方
法更能模拟肠癌在体内的生长环境。此外，transwell小室底部添加的专用基质对肿瘤组织内原有免疫细胞起到机械性固定的作用，使免疫细胞不易游离于培养基之中，从而促进了类器官的免疫细胞保留能力。因此，本专利技术所述方法与当下流行方法相比能够较大程度的保留免疫细胞，从而保留肿瘤的免疫微环境，从而进一步提高类器官模型对原始肿瘤的模拟程度，使类器官模型获得肿瘤免疫微环境研究和患者个性化免疫精准治疗方面的应用潜力。
附图说明
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种保留免疫细胞的结肠癌类器官构建方法，其特征在于，包括以下步骤：A1)新鲜结肠癌组织的清洗和机械性切碎；A2)切碎的组织块置于用离心管中，离心去除上清并用专用培养基重悬组织获得组织块悬液；A3)向transwell小室的底部加入专用基质，放置于细胞培养箱待基质凝固；A4)将组织块悬液与解冻的基质胶混合，接种于transwell小室底部凝固的基质上层；A5)待基质胶凝固后，在transwell小室下层加入专用培养基。2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤A1)中清洗所用溶液为含青霉素/链霉素的PBS；优选地，所述青霉素/链霉素的浓度为2％。3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤A2)中所述切碎的组织块直径为0.5
‑
2mm；优选地，组织块直径为0.6
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1.2mm。4.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤A2)中离心的转速为500g/min，离心时间为5min，其中升速和降速均为9。5.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤A2)和A5)中的所述专用培养基组分包括：DMED/F12培养基、R
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spondin1蛋白、表皮细胞生长因子、前列腺素E
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2、白细胞介素
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2；优选地，所述步骤A2)和A5)中所述专用培养基包括DMED/F12培养基、R
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【专利技术属性】
技术研发人员：章真，华国强，穆培源，吕涛，夏凡，申丽君，周淑娟，
申请(专利权)人：复旦大学附属肿瘤医院，
类型：发明
国别省市：