一种山羊地方性鼻内腺癌细胞ENA-1制造技术

本发明专利技术提供了一株新的山羊地方性鼻内腺癌细胞ENA

【技术实现步骤摘要】
一种山羊地方性鼻内腺癌细胞ENA
‑1

[0001]本专利技术属于细胞培养
，特别涉及一种山羊地方性鼻内腺癌细胞株。

技术介绍

[0002]山羊地方性鼻内腺癌(Enzootic nasal adenocarcinoma，ENA)是山羊的一种传染性、慢性肿瘤性疾病，该病由山羊地方性鼻内肿瘤病毒(Enzootic nasal tumor virus of goats，ENTV
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2)引起。ENA在全球范围内流行，山羊ENA在国内多个省份有报道，并且近年来有扩大的趋势，对养羊业造成了较大的经济损失。患病羊鼻腔内有肿瘤生长，随着肿瘤体积的增大，表现出流浆液性鼻液、呼吸音重等临床症状。该病病程较长，发病率不高但死亡率为100％，且没有疫苗或药物防控。
[0003]肿瘤细胞系是肿瘤研究中非常重要的工具，构建肿瘤细胞系有助于研究肿瘤发生的机制、筛选治疗药物。目前对山羊地方性鼻内腺癌细胞的研究较少，各数据库中还未有已鉴定的山羊地方性鼻内腺癌细胞株的记录，所以建立一种能稳定传代、形态均一的山羊地方性鼻内腺癌的细胞株对本疾病研究具有非常重要的意义。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在提供一种山羊地方性鼻内腺癌细胞株，该细胞株皮下接种免疫缺陷裸鼠后可以形成肿瘤、鼻腔接种健康山羊8个月后经电子计算机断层扫描观察到鼻腔筛骨黏膜处形成肿瘤，有助于研究山羊地方性鼻内腺癌体外治疗和模型建立。
[0005]本专利技术为实现上述目的所采取的技术方案是：
[0006]一种山羊地方性鼻内腺癌细胞株，命名为山羊地方性鼻内腺癌ENA
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1，保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址为中国武汉市武汉大学，保藏号为CCTCC NO：C2022232，保藏日期2022年7月12日。
[0007]所述山羊地方性鼻内腺癌细胞ENA
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1在倒置光学显微镜下观察其形态为多边形，在透射电子显微镜下观察其细胞表面有较多指状突起，细胞质内存在大量中间丝。
[0008]所述山羊地方性鼻内腺癌细胞ENA
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1的细胞倍增时间约为36h。
[0009]所述山羊地方性鼻内腺癌细胞ENA
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1经染色体核型分析表明其染色体数目异常。
[0010]所述山羊地方性鼻内腺癌细胞ENA
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1的腺上皮标志物角蛋白7、角蛋白18免疫组化阳性表达。
[0011]所述山羊地方性鼻内腺癌细胞ENA
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1的免疫缺陷裸鼠皮下移植瘤组织病理学表现为有包膜、分化良好的腺管样细胞。
[0012]所述山羊地方性鼻内腺癌细胞ENA
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1鼻腔接种健康山羊8个月后CT检查可以在山羊鼻腔筛骨迷路处发现肿瘤生长。
[0013]本专利技术的山羊地方性鼻内腺癌细胞ENA
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1通过如下方式获得：采集地方性鼻内腺癌患病山羊肿瘤组织，组织贴块法分离培养原代肿瘤细胞，连续稀释微孔板法完成单细胞克隆，建立纯化的肿瘤细胞株。
[0014]本专利技术的有益效果：
[0015]本专利技术构建了一种山羊地方性鼻内腺癌细胞ENA
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1，是一株新的山羊地方性鼻内腺癌细胞株，可在培养基中体外培养，能稳定传代、生长快速，保留腺上皮细胞免疫组化特征，皮下接种免疫缺陷裸鼠可以成瘤，鼻腔接种健康山羊8个月后能形成肿瘤，可作为山羊地方性鼻内腺癌体外治疗研究和构建山羊地方性鼻内腺癌动物模型的细胞材料。
附图说明
[0016]下面结合附图和具体实施方式对本专利技术做进一步详细说明：
[0017]图1：山羊地方性鼻内腺癌细胞ENA
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1倒置相差显微镜下照片，放大400倍。
[0018]图2：山羊地方性鼻内腺癌细胞ENA
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1透射电子显微镜下照片。
[0019]图3：山羊地方性鼻内腺癌细胞ENA
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1生长曲线。
[0020]图4：山羊地方性鼻内腺癌细胞ENA
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1染色体分析结果，放大1000倍。
[0021]图5：山羊地方性鼻内腺癌细胞ENA
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1腺上皮标志物CK7、CK18免疫荧光结果。
[0022]图6：山羊地方性鼻内腺癌细胞ENA
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1裸鼠移植瘤病理观察结果，放大400倍。
[0023]图7：健康山羊鼻腔接种山羊地方性鼻内腺癌细胞ENA
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18个月后鼻腔CT检查图片。
具体实施方式
[0024]实施例1山羊地方性鼻内腺癌细胞ENA
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1的分离、纯化与冻存
[0025]1.1样本取材及处理
[0026]取地方性鼻内腺癌发病死亡山羊鼻腔内肿块约1cm3大小放入含有抗生素(200U/mL青霉素+0.2mg/mL链霉素+0.1mg/mL头孢噻呋钠)的PBS中清洗3次，以尽可能的去掉表面微生物、黏液和血液，30min内带回实验室进行下一步处理。
[0027]取直径6cm的细胞培养皿，将肿块移入平皿内，用灭菌的手术刀片切成1mm3大小的小块。取若干25cm2细胞培养瓶，将切碎后的组织块放入培养瓶瓶底，每瓶放置约20
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30个组织块，缓慢加入约1mL RPMI
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1640培养基(包含10％胎牛血清、100U/mL青霉素、0.2mg/mL链霉素)，放入37℃、5％CO2的细胞培养箱中培养。
[0028]1.2细胞传代
[0029]组织块接种第3天补加培养基至5mL，每日观察细胞生长状况及形态，每3天更换一次培养基，7天后细胞铺满瓶底约80％，可以传代。弃掉全部旧培养基，用含1mmol/L EDTA的D
‑
PBS预洗细胞两次，每次3mL。加1mL 0.25％胰酶，轻轻晃动培养瓶使胰酶铺满细胞表面，消化5min后加入5mL培养基终止消化，充分吹打分散细胞，将全部细胞悬液转移至灭菌的10mL离心管中，1200r/min离心5min，小心地吸去上清，用1mL新培养基反复吹打分散细胞团块。用血球计数板对细胞进行计数，按照2
×
105个/mL进行传代继续培养。
[0030]1.3单克隆细胞纯化培养
[0031]当细胞生长至第5代时成纤维样细胞数量相对较少，细胞生长速度稳定。按照1.2中的方法常规消化细胞，离心重悬，用血球计数板计数细胞数量3次取平均值。采用连续稀释微孔板法，逐步稀释细胞成终浓度10个/mL的细胞悬液；取5个96孔板，每孔加入100μL充分吹打的细胞悬液；倒置显微镜下观察每孔，去掉没有观察到细胞的孔和细胞数量超过1个的孔；放入培养箱中培养3天，补加培养基至200μL；当细胞铺满孔底50％时，用少量胰酶消
化转移至24孔板扩大培养，建立单克隆。
[0032]1.4细胞冻存
[0033]当细胞生长至对数生长期，按照1.2中的方法消化、离心收集细胞，吸掉上清液后，加入本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种山羊地方性鼻内腺癌细胞株，其特征在于，命名为山羊地方性鼻内腺癌细胞ENA
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1，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C2022232。2.根据权利要求1所述的山羊地方性鼻内腺癌细胞株，其特征在于，所述山羊地方性鼻内腺癌细胞ENA
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1贴壁生长，呈长条形或三角形，细胞核明显，细胞浆丰富，与上皮样细胞形态相似。3.根据权利要求1所述的山羊地方性鼻内腺癌细胞株，其特征在于，所述山羊地方性鼻内腺癌细胞ENA
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1在透射电子显微镜下观察其表面有较多指状突起，细胞之间可见紧密连接，细胞核未见明显异型性，细胞质内存在较多中间丝穿行于细胞器之间形成细网，粗面内质网和线粒体嵴均有不同程度扩张，部分细胞质内可见大小80
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120nm的逆转录样病毒粒子。4.根据权利要求1所述的山羊地方性鼻内腺癌细胞株，其特征在于，所述山羊地方性鼻内腺癌细胞ENA...

【专利技术属性】
技术研发人员：姚大伟，李翎旭，祁伟凌，王珍，郭文晴，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：