抗猫CTLA4单克隆抗体的制备及其用途制造技术

本发明专利技术公开了一种抗猫CTLA4单克隆抗体的制备及其用途。本发明专利技术合成了猫CTLA4多肽，偶联KLH蛋白后加入等体积的弗氏佐剂（200μl）混合乳化后作为小鼠免疫抗原，通过背部左腹皮下多点注射免疫Balb/c小鼠；其中只有首次小鼠免疫用弗氏完全佐剂，二次、三次、四次加强免疫都用弗氏不完全佐剂，最后一次用少量CTLA4多肽抗原冲击免疫。将ELISA检测中效价高的小鼠脾细胞，通过PEG方法与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合，采用选择培养基，筛选出细胞融合后的杂交瘤细胞；再通过间接酶联免疫法筛选细胞并进行四次亚克隆，最终得到1株抗猫CTLA4单克隆抗体细胞株，及其分泌的单克隆抗体。得到的抗猫CTLA4单克隆抗体亲和力高，能有效识别细胞表面的CTLA4蛋白，可用于Western Blot和流式检测应用。用。

【技术实现步骤摘要】
抗猫CTLA4单克隆抗体的制备及其用途


[0001]本专利技术属于生物技术中的抗体制备领域，特别是涉及抗猫CTLA4单克隆抗体的制备及其用途。

技术介绍

[0002]CTLA4全名细胞毒T淋巴细胞相关抗原4，又名CD152，其基因定位于2号染色体长臂33带（2q33），主要表达于活化的T细胞表面，与T细胞表面的协同刺激分子受体CD28具有高度的同源性。CTLA4和CD28均为免疫球蛋白超家族成员，二者与相同的配体CD86（B7
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2）和CD80（B7
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1）结合。CD28信号传导促进细胞因子IL
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2 mRNA的产生和进入细胞周期、T细胞存活、T辅助细胞分化和免疫球蛋白同型转换。与CD28相反，CTLA4抑制T细胞的活化,参与免疫反应的负调节。基因重组的CTLA4 Ig可在体内外有效、特异地抑制细胞和体液免疫反应，对移植排斥反应及各种自身免疫性疾病有显著的治疗作用，毒副作用极低，是目前被认为较有希望的新的免疫抑制药物。在宠物自身免疫病和肿瘤研究中，缺乏各种靶向单克隆抗体。因此，开发犬源或猫源单克隆抗体对宠物自身免疫病和肿瘤的免疫疗法和疾病的诊断具有重要的意义。

技术实现思路

[0003]本专利技术的目的在于提供一种高亲和力、高生物活性的靶向于猫CTLA4的单克隆抗体制备方法及其Western Blot和流式应用验证。
[0004]为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：
[0005]第一方面，本专利技术提供了一种合成猫CTLA4多肽氨基酸序列，抗原多肽序列为SEQ ID NO 1。
[0006]第二方面，本专利技术提供一种结合猫CTLA4的单克隆抗体，所述单克隆抗体在制备过程中，免疫小鼠所用的抗原多肽序列为SEQ ID NO.1，所述单克隆抗体的重链和轻链可变区的氨基酸序列分别是SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列，所述单克隆抗体的重链和轻链可变区的核苷酸序列分别是SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列。
[0007]第三方面，本专利技术提供一种结合猫CTLA4的单克隆抗体。
[0008]第四方面，本专利技术提供了两种所述的单克隆抗体在检测猫CTLA4表达蛋白的应用。
[0009]与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：
[0010]本专利技术合成猫CTLA4多肽氨基酸序列偶联KLH蛋白，记为多肽CTLA4
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KLH，经DMSO溶解和PBS稀释，加入等体积的弗氏佐剂（200μl）混合乳化后作为小鼠免疫抗原，通过背部左腹皮下多点注射免疫Balb/c小鼠；其中只有首次小鼠免疫用弗氏完全佐剂，二次、三次、四次加强免疫都用弗氏不完全佐剂，最后一次用少量CTLA4多肽抗原冲击免疫。将ELISA检测中效价高的小鼠脾细胞，通过PEG方法与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合，采用选择培养基，筛选出细胞融合后的杂交瘤细胞；再通过间接竞争酶联免疫法筛选细胞并进行四次亚克隆，最终得到了猫CTLA4单克隆抗体细胞株，及其分泌的单克隆抗体。
[0011]本专利技术提供的靶向于猫CTLA4的单克隆抗体对猫CTLA4蛋白具有高亲和力、高生物活性，所述抗体能够与猫CTLA4抗原高亲和力结合，有效识别细胞表面的CTLA4蛋白，可用于Western Blot和流式中对于猫CTLA4蛋白的检测。
附图说明
[0012]图1为实施例2中猫CTLA4单克隆抗体的聚丙烯酰胺凝胶电泳图；
[0013]图2为实施例3中猫CTLA4单克隆抗体的Western Blot实验结果；
[0014]图3为实施例4中猫CTLA4单克隆抗体的流式试验结果。
实施方式
[0015]为更进一步阐述本专利技术所采取的技术手段及其效果，以下进一步说明本专利技术的技术方案结合附图并通过具体实施方式。
[0016]实施例1 筛选杂交瘤细胞株
[0017]免疫血清的制备：
[0018]选择3只4
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6周龄雌性Balb/c小鼠，对小鼠进行编号（1~3号）。然后进行首次免疫，将多肽CTLA4
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KLH与弗氏完全佐剂（厂家Sigma，货号F5881）等体积混合，进行抗原乳化，用于皮下注射，每只小鼠400μl。2周后进行第二次免疫，将多肽CTLA4
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KLH与弗氏不完全佐剂（厂家Sigma，货号F5506）等体积混合，进行抗原乳化，用于皮下注射，每只小鼠400μl。2周后进行第三次免疫，将抗原多肽CTLA4
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KLH与弗氏不完全佐剂等体积混合，进行抗原乳化，用于皮下注射，每只小鼠400μl。第三次免疫一周后，尾静脉采血30μl，凝血后离心收集免疫血清。用ELISA检测免疫血清的效价，以未经免疫的小鼠血清为阴性血清。效价检测结果如表1所示：
[0019]表1 经三次免疫后3只小鼠的尾血效价
[0020]血清稀释比例1号1号2号2号3号3号阴性血清阴性血清1：10003.71033.69243.70783.69703.68473.69470.05420.05981：20003.72203.70643.72023.71393.59523.68190.05490.05831：40003.72123.68703.65093.66443.74263.67590.05600.05011：80003.70613.68363.62953.62013.65343.66180.07500.05331：160003.64153.60093.50243.44983.52023.48900.08350.05151：320003.51693.56032.79172.78933.32543.18260.06530.06641：640003.11302.81301.48941.59272.65282.89410.06730.07551：1280002.42542.29381.15711.09801.80651.62770.08530.0778
[0021]结果显示，经三次免疫后的3只小鼠尾血血清效价相近，均可达到1:128000以上，满足后续细胞融合的要求。
[0022]细胞融合：
[0023]在细胞融合前一周准备小鼠骨髓瘤细胞SP2/0，调整细胞状态至对数生长期，并选择ELISA效价最高的1号小鼠，进行加强免疫50μl（抗原多肽CTLA4
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KLH腹腔注射）。一周后，取小鼠脾脏，机械破碎后收集脾细胞，200目筛网过滤，PBS洗涤3次；收集小鼠骨髓瘤细胞SP2/0，PBS洗涤3次；分别对小鼠脾细胞和SP2/0细胞进行计数，然后按SP2/0:脾细胞=1:2的
比例进行混合，混合后离心弃去PBS，使用化学融合（PEG）进行细胞融合，融合结束，细胞离心后加入含HAT（厂商Gibco，货号20160017）的完全培养基，重悬混匀细胞，铺板于96孔板中，于融合后7天进行一次全部换液，继续培养3天后用于杂交瘤细胞的本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种猫CTLA4多肽氨基酸序列，其特征在于，抗原多肽序列为SEQ ID NO.1。2.一种根据权利要求1所述的猫CTLA4多肽的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体的重链和轻链可变区的氨基酸序列分别是SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列。3.根据权利要求2所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体的重链和轻链可变区的核苷酸序列分别是SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列。4....

【专利技术属性】
技术研发人员：张娜，兰迪，姜阜衫，
申请(专利权)人：卫仕宠物营养研究院芜湖有限公司，
类型：发明
国别省市：