一种SjHNF4多肽抗体、制备方法及应用技术

本发明专利技术公开了一种SjHNF4多肽抗体、制备方法及应用。制备方法包括以下步骤：下载SjHNF4蛋白序列，筛选多肽序列，在N端增添一个半胱氨酸，随后进行多肽合成和纯化，偶联得到重组多肽，并将偶联的多肽与弗氏完全佐剂混合得到混合物；利用混合物免疫哺乳动物，采取该哺乳动物的心脏血液并分离血清，获得多肽抗体。利用ELISA方法检测多肽抗体效价，然后用多肽亲和层析柱纯化多肽抗体。最后通过WesternBlot和免疫荧光实验检测抗体与抗原的结合亲和力。本发明专利技术所得多肽抗体具有高纯度(不低于90％)和高效价(不低于512000)，纯度和免疫原性都较好，可满足多种实验需求并具有商业化价值。可满足多种实验需求并具有商业化价值。可满足多种实验需求并具有商业化价值。

【技术实现步骤摘要】
一种SjHNF4多肽抗体、制备方法及应用


[0001]本专利技术涉及一种SjHNF4多肽抗体、制备方法及应用。属于分子生物学


技术介绍

[0002]核受体(NRs)是后生动物中关键的转录调控因子，在许多重要的生命过程中起着重要调节作用，包括细胞稳态、分化、增殖、发育。典型的NRs蛋白质结构包含一个N端
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A/B结构域、一个C区DNA结合结构域(DBD)、一个铰链(D区)和一个C
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端配体结合结构域(LBD)。血吸虫病是一类严重却被忽视的热带病，对人类造成一系列的病理损害。血吸虫病主要由日本血吸虫、曼氏血吸虫和埃及血吸虫三种血吸虫引起，血吸虫寄生在宿主静脉内对宿主的肝脏、肠道等部位造成不同程度的损伤，吡喹酮是治疗血吸虫病唯一有效的药物，但其存在副作用、耐药性等缺点。寻找新的药物靶点是至关重要的，核受体作为生物体内重要的靶标分子，在血吸虫的研究中也逐渐兴起。
[0003]其中，日本血吸虫中有4个NRs的全长cDNA已被克隆和研究，包括视黄醇X受体1(SjRXR1)，SjRXR2，甲状腺激素受体(SjTHRβ)和过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR
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γ。肝细胞核因子4(HNF4)属于NRs家族，已在曼氏血吸虫和日本血吸虫的基因组中被鉴定。2020年的一篇研究对曼氏血吸虫进行了单细胞测序分析筛选出对血吸虫血液喂养，肠道维持和体内病理密切相关的靶标HNF4。这些研究显示HNF4对于血吸虫的各项生命活动是至关重要的。但是市面上尚无针对血吸虫HNF4的商业化抗体，并且重组蛋白抗体特异性差，单克隆抗体制备周期长难度高，使得目前对HNF4的研究仅停留在基因层面，并未表征其具体的生物学功能。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的是为克服上述现有技术的不足，提供一种SjHNF4多肽抗体、制备方法及应用，特异性好，纯度高，可用于SjHNF4蛋白水平的功能研究，有助于推动日本血吸虫核受体的进展。
[0005]为实现上述目的，本专利技术采用下述技术方案：
[0006]1、一种SjHNF4多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。从NCBI数据库中下载SjHNF4蛋白序列，使用OptimumAntigen
TM
在线网站分析SjHNF4全长蛋白序列并筛选符合要求的多肽序列，即得。
[0007]2、一种SjHNF4多肽抗体的制备方法，先在前述SjHNF4多肽的N端加一个半胱氨酸C，得到如SEQ ID NO.2所示的多肽，然后将该多肽与载体蛋白交联形成交联多肽，再利用交联多肽免疫哺乳动物，采取该哺乳动物的心脏血液并分离血清，即得。
[0008]作为优选的技术方案之一，所述多肽抗体的效价在1：512000以上。
[0009]作为优选的技术方案之一，所述载体蛋白为匙孔血蓝蛋白(KLH)，多肽的巯基与KLH的氨基通过MBS交联剂形成交联多肽。
[0010]作为优选的技术方案之一，交联多肽与弗氏完全佐剂混合得到混合物，将混合物
对哺乳动物皮下注射实现免疫。
[0011]作为优选的技术方案之一，免疫包括3次，初次免疫后在第14天和第35天进行加强免疫，第三次免疫后7天，对哺乳动物进行心脏采血。
[0012]作为优选的技术方案之一，所述哺乳动物选自新西兰大白兔、日本大耳兔、小鼠中的任一种。
[0013]作为优选的技术方案之一，所得多肽抗体采用亲和层析柱进行纯化。
[0014]3、利用上述制备方法得到的一种SjHNF4多肽抗体。
[0015]4、上述一种SjHNF4多肽抗体在制备日本血吸虫病检测试剂盒中的应用。
[0016]作为优选的技术方案之一，所述试剂盒用于检测日本血吸虫不同发育阶段的SjHNF4蛋白水平。
[0017]5、上述一种SjHNF4多肽抗体在检测SjHNF4与蛋白或DNA互作中的应用。
[0018]本专利技术的有益效果：
[0019]本专利技术从NCBI数据库中下载SjHNF4蛋白序列，使用OptimumAntigen
TM
在线网站分析SjHNF4全长蛋白序列并筛选符合要求的多肽序列，在N端增添一个半胱氨酸以助于交联，随后进行多肽合成和纯化，使用MBS活化KLH将合成的多肽进行偶联得到重组多肽，并将偶联的多肽与弗氏完全佐剂混合得到混合物；将混合物皮下注射两只新西兰大白兔，进行两次加强免疫，最后采取新西兰兔心脏血，分离血清获得多肽抗体。利用ELISA方法检测多肽抗体效价，然后用多肽亲和层析柱纯化多肽抗体。最后通过Western Blot和免疫荧光实验检测抗体对内源性抗原的结合亲和力。
[0020]本专利技术所用的多肽抗原根据免疫原性、亲水性、灵活性、合成难易程度等条件进行筛选，其筛选方法适用于其他物种的蛋白。本专利技术中所用的交联多肽及与佐剂的混合比例可按本领域常规方法实施，用于免疫的动物包括新西兰大白兔、日本大耳兔、小鼠等。所述的动物免疫包括3次免疫，初次免疫后在第14天和第35天进行加强免疫，每次免疫7天后，用间接ELISA方法检测免疫应答水平。最后使用包被有抗原的亲和层析柱纯化多肽抗体。利用本专利技术提供的方法所获得的多肽多克隆抗体的纯度不低于90％，效价不低于512000，纯度和免疫原性都较好，可满足多种实验需求。
[0021]具体优势如下：
[0022](1)本专利技术制备抗体的过程解决了传统的重组蛋白多克隆抗体的不足之处如重组蛋白难获得和纯化、抗体效价低、特异性不好等问题；
[0023](2)利用在线网站OptimumAntigen
TM
筛选的多肽序列效果好并且合成容易、成本低，非常适合大量生产抗原用于制备多肽抗体；
[0024](3)本专利技术整个过程相较传统的多克隆抗体和单克隆抗体制备周期大大缩短，从抗原筛选到抗体纯化整个过程仅需45天，提高了研究效率；
[0025](4)通过本专利技术的制备方法得到的多肽抗体经过SDS
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PAGE鉴定纯度、ELISA检测效价，不仅纯度高(＞90％)，效价高(＞512000)，完全满足实验需求；
[0026](5)经过Western Blot实验和免疫荧光实验证明本专利技术所制备的多肽多克隆抗体能识别日本血吸虫体内不同发育阶段的SjHNF4，可用于SjHNF4蛋白水平的检测，也满足免疫共沉淀实验(IP)、染色质免疫共沉淀(CHIP)等实验需求，有利于SjHNF4互作蛋白的研究以及与下游基因结合的启动子motif分析，大大推动了日本血吸虫中核受体的研究，为从核
受体中寻找针对日本血吸虫可靠的药物靶标奠定了基础。
附图说明
[0027]图1为使用OptimumAntigen
TM
在线网站分析SjHNF4全长蛋白序列的抗原性、表面可及性、亲水性等。
[0028]图2为合成多肽的HPLC纯度检测结果，纯度为90.1％。
[0029]图3为SjHNF4多肽抗体的SDS
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种SjHNF4多肽，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。2.一种SjHNF4多肽抗体的制备方法，其特征在于，先在权利要求1所述多肽的N端加一个半胱氨酸C，得到如SEQ ID NO.2所示的多肽，然后将该多肽与载体蛋白交联形成交联多肽，再利用交联多肽免疫哺乳动物，采取该哺乳动物的心脏血液并分离血清，即得。3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述多肽抗体的效价在1：512000以上。4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述载体蛋白为匙孔血蓝蛋白，多肽的巯基与KLH的氨基通过MBS交联剂形成交联多肽。5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄静，吴开娟，黄帅钦，
申请(专利权)人：中南大学，
类型：发明
国别省市：