合成猫CD19多肽氨基酸序列、结合猫CD19的单克隆抗体及应用制造技术

本发明专利技术合成猫CD19多肽氨基酸序列、结合猫CD19的单克隆抗体及应用，合成猫CD19多肽氨基酸序列偶联KLH蛋白，经DMSO溶解和PBS稀释，加入等体积的弗氏佐剂(200μl)混合乳化后作为小鼠免疫抗原，通过背部左腹皮下多点注射免疫Balb/c小鼠；其中只有首次小鼠免疫用弗氏完全佐剂，二次、三次、四次加强免疫都用弗氏不完全佐剂，最后一次用少量CD19多肽抗原冲击免疫。将ELISA检测中效价高的小鼠脾细胞，通过PEG方法与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合，筛选出细胞融合后的杂交瘤细胞；再通过间接竞争酶联免疫法筛选细胞并进行四次亚克隆，得到猫CD19单克隆抗体细胞株，及其分泌的单克隆抗体。得到的猫CD19单克隆抗体亲和力高，能有效识别细胞表面的CD19蛋白，可用于WesternBlot和流式检测应用。用。用。

【技术实现步骤摘要】
合成猫CD19多肽氨基酸序列、结合猫CD19的单克隆抗体及应用


[0001]本专利技术属于生物技术中的抗体制备领域，特别是涉及合成猫CD19多肽氨基酸序列、结合猫CD19的单克隆抗体及应用。所述单克隆抗体能靶向于猫CD19，并能用于Western Blot和流式应用验证。

技术介绍

[0002]CD19是B细胞表面表达的一种CD分子(即白细胞分化抗原)，属于Ig超家族。除浆细胞外的所有B细胞系，恶性B细胞与FDC都会表达该分子。CD19的作用是参与B细胞的增殖、分化、活化及抗体产生，促进BCR的信号转导，可视为B细胞的标志，帮助鉴定B细胞，在诊断B细胞系肿瘤(白血病、淋巴瘤)上也有重要意义。
[0003]CD19与CD21、CD81及CD225共同形成BCR复合体，能减少BCR介导的B细胞激活阈值，更容易激活B细胞也包括恶性的B细胞，其中，CD21提供与表面免疫球蛋白间的桥梁，CD81调节CD19的表达，CD19则发挥主要的信号传导作用。目前人类临床上以CD19为靶点治疗恶性淋巴肿瘤的手段主要是嵌合抗原受体T细胞(CAR
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T)疗法和抗体偶联药物(ADCs)。
[0004]但目前大多数研究均集中在人源靶向研究中，在宠物自身免疫病和肿瘤研究中，缺乏各种靶向单克隆抗体。因此，开发犬源或猫源单克隆抗体对宠物自身免疫病和肿瘤的免疫疗法和疾病的诊断具有重要的意义。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于提供一种合成猫CD19多肽氨基酸序列、高亲和力高生物活性的靶向于猫CD19的单克隆抗体及其Western Blot和流式应用验证。
[0006]为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：
[0007]第一方面，本专利技术提供了一种合成猫CD19多肽氨基酸序列，抗原多肽序列为SEQ ID NO.1。
[0008]第二方面，本专利技术提供一种结合猫CD19的单克隆抗体，所述单克隆抗体在制备过程中，免疫小鼠所用的抗原多肽序列为SEQ ID NO.1，所述单克隆抗体的重链和轻链可变区的氨基酸序列分别是SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列。
[0009]所述结合猫CD19的单克隆抗体，所述单克隆抗体的重链和轻链可变区的核苷酸序列分别是SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列。
[0010]第三方面，本专利技术提供一种结合猫CD19的单克隆抗体。
[0011]第四方面，本专利技术提供了所述的单克隆抗体在检测猫CD19表达蛋白的两种应用。
[0012]与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：
[0013]本专利技术合成猫CD19多肽氨基酸序列偶联KLH蛋白，记为多肽CD19
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KLH，经DMSO溶解和PBS稀释，加入等体积的弗氏佐剂(200μl)混合乳化后作为小鼠免疫抗原，通过背部左腹皮下多点注射免疫Balb/c小鼠；其中只有首次小鼠免疫用弗氏完全佐剂，二次、三次、四次
加强免疫都用弗氏不完全佐剂，最后一次用少量CD19多肽抗原冲击免疫。将ELISA检测中效价高的小鼠脾细胞，通过PEG方法与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合，采用选择培养基，筛选出细胞融合后的杂交瘤细胞；再通过间接竞争酶联免疫法筛选细胞并进行四次亚克隆，最终得到了猫CD19单克隆抗体细胞株，及其分泌的单克隆抗体。
[0014]本专利技术提供的靶向于猫CD19的单克隆抗体对猫CD19蛋白具有高亲和力、高生物活性，所述抗体能够与猫CD19抗原高亲和力结合，有效识别细胞表面的CD19蛋白，可用于Western Blot和流式中对于猫CD19蛋白的检测。
附图说明
[0015]图1为实施例2中结合猫CD19的单克隆抗体的聚丙烯酰胺凝胶电泳图；
[0016]图2为实施例3中结合猫CD19的单克隆抗体的Western Blot实验结果。
[0017]图3为实施例4中结合猫CD19的单克隆抗体的流式验证结果图。
具体实施方式
[0018]为更进一步阐述本专利技术所采取的技术手段及其效果，以下结合附图和实施例进一步说明本专利技术的技术方案。
[0019]实施例1筛选杂交瘤细胞株
[0020]免疫血清的制备
[0021]选择3只4
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6周龄雌性Balb/c小鼠，对小鼠进行编号(1～3号)。然后进行首次免疫，将多肽CD19
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KLH与弗氏完全佐剂(厂家Sigma，货号F5881)等体积混合，进行抗原乳化，用于皮下注射，每只小鼠400μl。2周后进行第二次免疫，将多肽CD19
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KLH与弗氏不完全佐剂(厂家Sigma，货号F5506)等体积混合，进行抗原乳化，用于皮下注射，每只小鼠400μl。2周后进行第三次免疫，将抗原多肽CD19
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KLH与弗氏不完全佐剂等体积混合，进行抗原乳化，用于皮下注射，每只小鼠400μl。第三次免疫一周后，尾静脉采血30μl，凝血后离心收集免疫血清。用ELISA检测免疫血清的效价，以未经免疫的小鼠血清为阴性血清。效价检测结果如表1所示：
[0022]表1经三次免疫后3只小鼠的尾血效价
[0023][0024]结果显示，经三次免疫后的3只小鼠尾血血清效价相近，均可达到1:128000以上，
均呈阳性，远大于空白血清，满足后续细胞融合的要求。
[0025]细胞融合
[0026]在细胞融合前一周准备小鼠骨髓瘤细胞SP2/0，调整细胞状态至对数生长期，并选择ELISA效价最高的2号小鼠，进行加强免疫50μl(抗原多肽CD19
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KLH腹腔注射)。一周后，取小鼠脾脏，机械破碎后收集脾细胞，200目筛网过滤，PBS洗涤3次；收集小鼠骨髓瘤细胞SP2/0，PBS洗涤3次；分别对小鼠脾细胞和SP2/0细胞进行计数，然后按SP2/0:脾细胞＝1:2的比例进行混合，混合后离心弃去PBS，使用化学融合(PEG)进行细胞融合，融合结束，细胞离心后加入含HAT(厂商Gibco，货号20160017)的完全培养基，重悬混匀细胞，铺板于96孔板中，于融合后7天进行一次全部换液，继续培养3天后用于杂交瘤细胞的筛选。
[0027]杂交瘤细胞的筛选采用ELISA检测法，筛选单克隆阳性孔。细胞融合后进行筛选、复检、反筛，第一、二、三次、四次亚克隆后也进行筛选、复检、反筛，最终筛选得到阳性杂交瘤细胞株，并将其命名为3H9B1B2C5A12。
[0028]实施例2抗体的制备
[0029]将实施例1筛选得到的杂交瘤细胞株通过腹腔注射方式，注射到小鼠腹腔，1
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106个细胞/只小鼠，7天后小鼠腹腔明显膨胀后处死小鼠，收集腹水，并进行SDS
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PAGE电泳，检测结果如图1所示。从图1中可以看出，电泳结果中出现了两个条带，它们分别是所制备的抗体的重链和轻链，分别为50kDa和21kDa，与预计的抗体蛋白大小一致，表明本专利技术制备得到了结合猫本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.合成猫CD19多肽氨基酸序列，其特征在于，抗原多肽序列为SEQ ID NO.1。2.一种结合猫CD19的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体在制备过程中，免疫小鼠所用的抗原多肽序列为SEQ ID NO.1，所述单克隆抗体的重链和轻链可变区的氨基酸序列分别是SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列。3.根据权利要求2所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体的重链和轻链可变区的核苷酸序列分别是SEQ ID NO.4和SEQ ID N...

【专利技术属性】
技术研发人员：沈丽雅，彭玥晗，姜雪，
申请(专利权)人：卫仕宠物营养研究院芜湖有限公司，
类型：发明
国别省市：