携带一个或多个P基因突变的RSV疫苗制造技术

提供了编码具有减毒表型的重组呼吸道合胞病毒(RSV)变体的多核苷酸，其包含修饰的RSV基因组或反基因组，所述修饰的RSV基因组或反基因组编码在一个或多个氨基酸残基处不同于亲本RSV蛋白P的突变RSV蛋白P。在一些实施方案中，所述多核苷酸是重组的。本发明专利技术还涉及用所述RSV变体或含有所述RSV变体的药物组合物接种动物或者通过向动物施用所述RSV变体来诱导免疫应答的方法，还涉及生产RSV变体疫苗的方法。在一些实施方案中，所述动物是人。所述动物是人。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】携带一个或多个P基因突变的RSV疫苗
关于联邦资助的研究或开发的声明
[0001]支持本申请的研究由美国卫生和人力服务部进行。这项研究得到了国家卫生研究所的NIAID的校内研究部的校内研究项目的支持。政府享有本专利技术的某些权利。在先申请的交叉引用
[0002]本申请要求2020年5月13日提交的美国临时专利申请第63/023,949号的权益，所述美国临时专利申请在此通过引用以其整体并入。以电子方式提交的材料通过引用并入
[0003]通过引用以其整体并入本文的是随本文同时提交的并且如下确定的计算机可读的核苷酸/氨基酸序列表：名称为“754331_ST25.txt”，2021年5月12日创建的一份179,715字节ASCII(文本)文件。专利技术背景
[0004]呼吸道合胞病毒(RSV，也称为正肺炎病毒)属于RNA病毒的肺病毒科，以前属于副粘病毒科。RSV是具有线性负义RNA基因组的包膜病毒。因此，RNA基因组在其被翻译之前首先被转录。基因组编码11种蛋白，即两种非结构蛋白(NS1和NS2)、结合RNA的核衣壳蛋白(N)、磷蛋白(P)、内部基质蛋白(M)、小疏水表面糖蛋白(SH)、粘附糖蛋白(G)、融合蛋白(F)、由相同mRNA编码的两种蛋白(M2
‑
1和M2
‑
2)以及大聚合酶蛋白(L)。对应于这11种蛋白质的开放阅读框的顺序是3
’‑
NS1
‑
NS2
‑
N
‑
P
‑
M
‑
SH
‑
G
‑
F
‑
M2
‑1‑
M2
‑2‑
L
‑5’
。
[0005]RSV是一种已知引起呼吸道感染的流行病原体，其可导致严重的疾病，甚至死亡，特别是在幼儿和老年人中。据估计，RSV在世界范围内引起超过3300万的下呼吸道疾病、300万的住院治疗，以及每年近200,000儿童死亡，其中许多死亡发生在发展中国家。然而，尽管RSV的流行和与这种感染相关的危险，迄今为止还没有成功地开发出RSV疫苗。因此，需要RSV疫苗，如基于本文公开内容的那些。专利技术概述
[0006]本专利技术提供了编码具有减毒表型的呼吸道合胞病毒(RSV)变体的多核苷酸，其包含修饰的RSV基因组或反基因组，所述修饰的RSV基因组或反基因组编码在一个或多个氨基酸残基处不同于亲本RSV蛋白P的突变RSV蛋白P。在一些实施方案中，所述多核苷酸是重组的。在一些实施方案中，所述修饰的RSV基因组或反基因组的至少一个基因是密码子对去优化的。
[0007]本专利技术还提供了包含本文所述的多核苷酸的RSV变体以及包含一种或多种RSV变体和至少一种赋形剂的药物组合物。在一些实施方案中，组合两种或更多种RSV变体以形成多价RSV疫苗组合物。
[0008]本专利技术还提供了接种对象的方法，其包括将如本文所述的药物组合物施用至动物；以及在动物中诱导免疫应答的方法，其包括将本文所述的一种或多种RSV变体施用至动物。在一些实施方案中，所述动物是人。
[0009]本专利技术还提供了生产RSV疫苗的方法，其包括在细胞中表达一种或多种本文所述的多核苷酸。
[0010]在下面的详述中提供了本专利技术的另外方面和实施方案。附图简述
[0011]图1比较了野生型RSV与密码子对去优化(CPD)RSV变体(Min A)的结构。
[0012]图2描绘了使用从32℃至40℃的温度增量增加以向Min A RSV变体施加温度应激的方案的示意图。
[0013]图3A说明了在图2所示的方案期间在32至40℃的每个温度下Min A RSV变体的病毒滴度。
[0014]图3B说明了在32℃下连续培养的Min A RSV变体(对照)的病毒滴度。
[0015]图4A和4B说明了分别在图3A和3B中所示的Min A RSV变体使用全基因组深度测序进行测序的点(第18代)。
[0016]图5描绘了总结在温度应激的Min A RSV变体(每个用谱系号表示)的磷蛋白(P)基因的核苷酸序列中鉴定的突变的图表，其中每个突变引起P蛋白的氨基酸序列改变(即，每个突变是非同义突变)。
[0017]图6描绘了用野生型RSV或某些Min ARSV变体感染的Vero细胞(MOI＝0.01pfu/细胞，37℃)中的病毒滴度。
[0018]图7描绘了用野生型RSV或某些Min ARSV变体感染的Vero细胞(MOI＝3pfu/细胞，37℃)中的病毒滴度。
[0019]图8描绘了在仓鼠中测试某些Min ARSV变体的复制和免疫原性的示意图。
[0020]图9描绘了某些Min ARSV变体的病毒滴度，证明了变体在仓鼠中的复制能力。
[0021]图10描绘了先前感染了某些Min ARSV变体的仓鼠中RSV中和抗体的水平。
[0022]图11描绘了先前在鼻甲(NT)和肺中被某些Min ARSV变体激发的仓鼠中的病毒滴度。
[0023]图12A
‑
H是描绘了某些RSV毒株的生长动力学(图12A
‑
12D)和噬菌斑大小(图12E
‑
12H)的图。
[0024]图13是描绘了与Min A RSV毒株相比，某些RSV毒株的RNA合成速率倍数增加的一组图。
[0025]图14A
‑
F是描绘了某些RSV毒株的蛋白质表达(图14A
‑
14D)以及描绘了某些RSV毒株的病毒产量(图14E
‑
14F)的一系列图和一个图片。
[0026]图15A
‑
B是描绘了某些RSV毒株(图15A)和相应对照(图15B)的温度应激测试结果的两个图。
[0027]图16A
‑
C是Min A和某些Min A衍生物的基因图谱示意图(图16A)，以及描绘了那些Min A衍生物的复制的图(图16B
‑
16C)。
[0028]图17A
‑
C是描绘了某些RSV毒株的复制(图17A)、保护功效(图17B)和免疫原性(图17C)的图。
[0029]图18A
‑
B是描绘了某些RSV毒株(图18A)和相应对照(图18B)的温度应激测试结果的两个图。专利技术详述
[0030]本专利技术提供了编码具有减毒表型的呼吸道合胞病毒(RSV)变体的多核苷酸，其包含修饰的RSV基因组或反基因组，所述修饰的RSV基因组或反基因组编码在一个或多个氨基
酸残基处不同于亲本RSV蛋白P的突变RSV蛋白P。在一些实施方案中，多核苷酸是重组的。在一些实施方案中，修饰的RSV基因组或反基因组的至少一个基因是密码子对去优化的。密码子对去优化
[0031]在一些实施方案中，减毒RSV变体的基因组或反基因组是密码子对去优化的(CPD)。CPD以及密码子去优化(CD)和增加二本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.编码具有减毒表型的重组呼吸道合胞病毒(RSV)变体的多核苷酸，其包含修饰的RSV基因组或反基因组，所述修饰的RSV基因组或反基因组编码在一个或多个氨基酸残基处不同于亲本RSV蛋白P的突变RSV蛋白P。2.如权利要求1所述的多核苷酸，其中所述突变RSV蛋白P具有在选自19
‑
34、107、229、234和235的一个或多个位置处不同于SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列的氨基酸序列。3.如权利要求1
‑
2中任一项所述的多核苷酸，其中所述突变RSV蛋白具有在至少第25位不同于SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列的氨基酸序列。4.如权利要求3所述的多核苷酸，其中所述氨基酸序列的第25位的残基是苏氨酸或天冬酰胺。5.如权利要求1
‑
4中任一项所述的多核苷酸，其中所述突变RSV蛋白具有在至少第27位不同于SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列的氨基酸序列。6.如权利要求5所述的多核苷酸，其中所述氨基酸序列的第27位的残基是谷氨酸或天冬酰胺。7.如权利要求1
‑
6中任一项所述的多核苷酸，其中所述突变RSV蛋白具有在至少第28位不同于SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列的氨基酸序列。8.如权利要求7所述的多核苷酸，其中所述氨基酸序列的第28位的残基是缬氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、亮氨酸或丝氨酸。9.如权利要求1
‑
8中任一项所述的多核苷酸，其中所述突变RSV蛋白具有在至少第32位不同于SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列的氨基酸序列。10.如权利要求9所述的多核苷酸，其中所述氨基酸序列的第32位的残基是苏氨酸。11.如权利要求1
‑
10中任一项所述的多核苷酸，其中所述突变RSV蛋白具有在至少第34位不同于SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列的氨基酸序列。12.如权利要求11所述的多核苷酸，其中所述氨基酸序列的第34位的残基是丝氨酸。13.如权利要求1
‑
12中任一项所述的多核苷酸，其中所述修饰的RSV基因组或反基因组的一个或多个ORF是密码子对去优化的。14.如权利要求1
‑
13中任一项所述的多核苷酸，其中编码一种或多种RSV蛋白NS1、NS2、N、P、M和SH的所述修饰的RSV基因组或反基因组的核苷酸序列与编码相同的一种或多种RSV蛋白NS1、NS2、N、P、M和SH的所述亲本RSV基因组或反基因组的核苷酸序列具有约70％至约95％的同一性。15.如权利要求14所述的多核苷酸，其中编码RSV蛋白NS1的所述修饰的RSV基因组或反基因组的核苷酸序列与编码RSV蛋白NS1的所述亲本RSV基因组或反基因组的核苷酸序列具有约75％至约95％的同一性。16.如权利要求15所述的多核苷酸，其中编码RSV NS1蛋白的所述修饰的RSV基因组或反基因组的核苷酸序列与编码RSV蛋白NS1的所述亲本RSV基因组或反基因组的核苷酸序列具有约87％的同一性。17.如权利要求16所述的多核苷酸，其中编码RSV NS1蛋白的所述修饰的RSV基因组或反基因组的核苷酸序列由SEQ ID NO:2的核苷酸99至518表示。18.如权利要求14
‑
17中任一项所述的多核苷酸，其中编码RSV蛋白NS2的所述修饰的RSV基因组或反基因组的核苷酸序列与编码RSV蛋白NS2的所述亲本RSV基因组或反基因组
的核苷酸序列具有约75％至约95％的同一性。19.如权利要求18所述的多核苷酸，其中编码RSV NS2蛋白的所述修饰的RSV基因组或反基因组的核苷酸序列与编码RSV蛋白NS2的所述亲本RSV基因组或反基因组的核苷酸序列具有约88％的同一性。20.如权利要求19所述的多核苷酸，其中编码RSV NS2蛋白的所述修饰的RSV基因组或反基因组的核苷酸序列由SEQ ID NO:2的核苷酸628至1002表示。21.如权利要求14
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20中任一项所述的多核苷酸，其中编码RSV蛋白N的所述修饰的RSV基因组或反基因组的核苷酸序列与编码RSV蛋白N的所述亲本RSV基因组或反基因...

【专利技术属性】
技术研发人员：彼得，
申请(专利权)人：美国卫生和人力服务部，
类型：发明
国别省市：