一种基因缺失的减毒非洲猪瘟病毒毒株及其构建方法和应用技术

本申请涉及一种减毒非洲猪瘟病毒毒株，其相对于野生型II型非洲猪瘟病毒在基因组中缺失以下基因片段：CD2V和I177L基因片段。CD2V和I177L基因片段。

【技术实现步骤摘要】
MV.2015.TheprogressiveadaptationofaGeorgianisolateofAfricanswinefevervirustoVerocellsleadstoagradualattenuationofvirulenceinswinecorrespondingtomajormodificationsoftheviralgenome.JVirol89:2324
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2332.)。因此，MGF360
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12L、MGF
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13L和MGF
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14L等MGF基因片段的这种极易发生自身突变和同源重组缺失或回补缺失部位的现象，极有可能会造成由上述文献1公开的缺失CD2v和MGF360(12L,13L,14L)基因的疫苗株制备的减毒活疫苗面临潜在的毒力返强安全风险。

技术实现思路

[0006]鉴于上述背景，本申请希望提供一种毒力强且稳定性好的减毒非洲猪瘟病毒毒株。具体来说，本申请涉及如下内容：
[0007]1、一种减毒非洲猪瘟病毒毒株，其相对于野生型II型非洲猪瘟病毒在基因组中缺失以下基因片段：CD2V和I177L基因片段；
[0008]优选缺失序列与SEQIDNO:1具有至少80％同一性的CD2V基因片段、以及缺失序列与SEQIDNO:2具有至少80％同一性的I177L基因片段；
[0009]更优选缺失序列如SEQIDNO:1所示的CD2V基因片段、以及序列如SEQIDNO:2所示的I177L基因片段。
[0010]2、根据项1所述的减毒非洲猪瘟病毒毒株，其中所述野生型II型非洲猪瘟病毒为选自下组的任一项：ASFV
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SY18、Georgia2008/1、Pig/HLJ/2018、Georgia2007/1、ASFVGZ2018、ASFVAnhui2018、ASFVGD2019、ASFVInnerMongolia2019。
[0011]3、根据项1或2所述的减毒非洲猪瘟病毒毒株的构建方法，其包括以下步骤：通过基因工程手段使野生型II型非洲猪瘟病毒的CD2V和I177L基因片段缺失。
[0012]4、根据项3所述的构建方法，其中所述基因工程手段为同源重组技术，其具体包括以下步骤：
[0013]利用同源重组将包含有CD2V基因的左右同源臂的同源重组转移载体和包含有I177L基因片段的左右同源臂的同源重组转移载体转染所述野生型II型非洲猪瘟病毒；
[0014]筛选同时缺失CD2V基因和I177L基因的减毒非洲猪瘟病毒毒株。
[0015]5、根据项4所述的构建方法，其中，所述方法包括以下步骤：S1)将CD2V基因的左右同源臂和第一筛选表达盒克隆至pBluescriptIIKS载体，获得第一同源重组转移载体；
[0016]S2)将I177L基因片段的左右同源臂和第二筛选表达盒克隆至pBluescriptIIKS载体，获得第二同源重组转移载体；
[0017]S3)将步骤S1)的第一同源重组转移载体用转染试剂转染至使用所述亲本II型非洲猪瘟病毒感染的原代PAM细胞中，通过所述第一筛选表达盒筛选获得缺失CD2V基因的第一重组病毒；
[0018]S4)将步骤S2)的第二同源重组转移载体用转染试剂转染至使用步骤S3)获得的第一重组病毒感染的原代PAM细胞中，通过所述第一筛选表达盒和第二筛选表达盒筛选获得同时缺失CD2V基因和I177L基因的第二重组病毒，作为减毒非洲猪瘟病毒毒株。
[0019]6、根据项5所述的构建方法，其中所述第一筛选表达盒和所述第二筛选表达盒为不同的筛选表达盒，且选自mCherry和EGFP表达盒的任一项。
[0020]7、根据项1或2所述的减毒非洲猪瘟病毒毒株的用于制备非洲猪瘟病毒 减毒活疫苗的用途。
[0021]8、一种非洲猪瘟病毒减毒活疫苗，其由项1或2所述的减毒非洲猪瘟病 毒毒株制备获得。
[0022]9、根据项8所述的非洲猪瘟病毒减毒活疫苗，其中的减毒非洲猪瘟病毒 的病毒含量≥10
7.0
TCID
50
/ml。
[0023]10、根据项8或9所述的非洲猪瘟病毒减毒活疫苗的制备方法，其包括 以下步骤：
[0024]T1)将项1或2所述的基因缺失的减毒非洲猪瘟病毒毒株接种原代细胞， 扩大培养，收获病毒液；
[0025]T2)以病毒含量≥10
7.0
TCID
50
/ml的病毒液直接或配合佐剂制成疫苗。
[0026]11、根据项10所述的制备方法，其中所述佐剂选自下组的一项或多项： 铝盐佐剂、蛋白类佐剂、核酸类佐剂、含脂类佐剂、混合佐剂和聚集体结构 佐剂，优选选自下组的一项或多项：白介素或干扰素。
[0027]本申请的技术方案实现的有益技术效果
[0028]本申请通过细致研究得出下述结论：专利文献CN113122511B(以下称文 献2)已公开一种I177L、CD2v和MGF基因(MGF360
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12L、MGF
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13L和 MGF
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14L)同时缺失的减毒疫苗株，其毒力减弱主要是MGF
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360基因缺失和 I177L基因缺失导致的，且表现出良好的免疫保护作用。然而，MGF基因为 多基因家族，本身具有自身复制插入的特点，缺失后可能出现因基因家族中 其他基因复制插入而导致缺失基因回补的情况，基因缺失的稳定性较差。其 次，据本申请的研究表明，MGF360基因可抑制宿主产生细胞因子，缺失后 可能导致被接种动物出现免疫过激或细胞因子风暴，使接种动物因过激的免 疫反应而造成器官的伤害。基于以上技术方案提供的基因缺失的减毒非洲猪 瘟病毒毒株在CD2v基因缺失的基础上，还缺失了I177L基因部分片段，获 得一种相对于野生毒株显著减毒(I177L基因部分片段缺失的减毒效果)、能 够高效稳定增殖且病毒滴度较高、保持较高的毒力和免疫原性、种毒稳定性 好、并可以区别于野生毒株(利用CD2v基因的缺失)的非洲猪瘟病毒毒株 (rASFV GZ2018ΔCD2v/I177L)。经试验证明，利用本申请提供的rASFVGZ2018ΔCD2v/I177L毒株对实验猪进行接种后，按照低剂量(10
3.0
TCID50/ 头)接种和高剂量(10
5.0
TCID50/头)接种实验猪，均不会出现实验猪体温明显 升高(不超过40.3℃)、发病或死亡现象，表现出与文献2公开的基因缺失株 相同的安全性，且比文献1和文献3(Development of a highly effective Africanswine fever virus vaccine by deletion of the I177L gene results in sterileimmunity against the current epidemic Eurasia strain，Journal of Vi本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种减毒非洲猪瘟病毒毒株，其相对于野生型II型非洲猪瘟病毒在基因组中缺失以下基因片段：CD2V和I177L基因片段；优选缺失序列与SEQ ID NO:1具有至少80％同一性的CD2V基因片段、以及缺失序列与SEQ ID NO:2具有至少80％同一性的I177L基因片段；更优选缺失序列如SEQ ID NO:1所示的CD2V基因片段、以及序列如SEQ ID NO:2所示的I177L基因片段。2.根据权利要求1所述的减毒非洲猪瘟病毒毒株，其中所述野生型II型非洲猪瘟病毒为选自下组的任一项：ASFV
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SY18、Georgia 2008/1、Pig/HLJ/2018、Georgia 2007/1、ASFV GZ2018、ASFVAnhui 2018、ASFV GD 2019、ASFV InnerMongolia 2019。3.根据权利要求1或2所述的减毒非洲猪瘟病毒毒株的构建方法，其包括以下步骤：通过基因工程手段使野生型II型非洲猪瘟病毒的CD2V和I177L基因片段缺失。4.根据权利要求3所述的构建方法，其中所述基因工程手段为同源重组技术，其具体包括以下步骤：利用同源重组将包含有CD2V基因的左右同源臂的同源重组转移载体和包含有I177L基因片段的左右同源臂的同源重组转移载体转染所述野生型II型非洲猪瘟病毒；筛选同时缺失CD2V基因和I177L基因的减毒非洲猪瘟病毒毒株。5.根据权利要求4所述的构建方法，其中，所述方法包括以下步骤S1)将CD2V基因的左右同源臂和第一筛选表达盒克隆至pBluescript II KS载体，获得第一同源重组转移载体；S2)将I177L基因片段的左右同源臂和第二筛选表达盒克隆至pBluescr...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘建奇，陈鸿军，武瑾贤，王衡，狄栋栋，李劼，谢振华，屠颉，张健，龚浪，陈坚，宋庆庆，张翀宇，
申请(专利权)人：金宇保灵生物药品有限公司，
类型：发明
国别省市：