一种检测SARS-CoV-2抗体中和活性的方法技术

本申请涉及生物技术领域，具体涉及一种类病毒颗粒的制备方法，以及根据所述方法制备的类病毒颗粒。本申请还涉及一种筛选抗SARS

【技术实现步骤摘要】
一种检测SARS
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CoV
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2抗体中和活性的方法


[0001]本申请涉及生物
，具体涉及一种SARS
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CoV
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2类病毒颗粒的制备方法，以及根据所述方法制备的SARS
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CoV
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2类病毒颗粒。本申请还涉及一种筛选抗SARS
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CoV
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2抗体或者检测SARS
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CoV
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2抗体中和活性的方法，以及一种筛选能够抑制SARS
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CoV
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2感染细胞的候选药物的方法。

技术介绍

[0002]假病毒是指一种反转录病毒整合了另外一种病毒的囊膜糖蛋白，从而形成的具有外源性病毒囊膜，而基因组仍保持着反转录病毒本身基因组特性的病毒。假病毒的产生过程为用带有一种病毒外膜蛋白基因的质粒与带有另一种病毒骨架基因的质粒共转染到包装细胞(如293T细胞)中，外膜蛋白基因在包装细胞表面表达出外膜蛋白，另一种病毒的基因在包装细胞中转录翻译组装成病毒颗粒，病毒颗粒出芽时会被细胞表面表达的外膜蛋白所包装，即形成假病毒。
[0003]假病毒内部核酸为缺陷型基因组，不能表达假病毒颗粒表面蛋白，因此病毒表面蛋白需要通过额外的质粒转染或细胞系稳定表达来实现。研究表明，新冠病毒SARS
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2是由病毒S蛋白通过细胞hACE2受体结合进入细胞，因此构建新冠假病毒选择的胞膜蛋白为S蛋白。假病毒的骨架载体包含了病毒转录、包装、整合等基因序列，为假病毒提供除膜蛋白外的其余所有蛋白。由于通常情况下假病毒只进行一轮感染，不具备复制增殖能力，因此可以使假病毒系统携带报告基因，从而方便后续的定性、定量研究。
[0004]利用假病毒感染hACE2基因敲入小鼠的动物模型，可以模拟SARS
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2感染进入细胞的过程，用来评价体内交叉保护作用。因此假病毒适合产生中和抗体的疫苗效果评价。假病毒系统具有其独特的优势。由于假病毒不具备自我复制能力，只能进行单一周期的侵染，因此降低了病毒突变率且具有较高的生物安全性，可以降低实验室操作的风险。
[0005]因此，需要一种替代活病毒用于疫苗研发及免疫原性中和抗体水平检测的方法，以抗体筛选和检测过程中的操作难度与试验成本。

技术实现思路

[0006]本申请的专利技术人经过大量实验和反复摸索，对类病毒颗粒的制备方法，以及检测SARS
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2抗体中和活性的方法进行了优化，使得检测结果具有较高的准确性，良好的重复性以及特异性。更进一步的，将上述方法与利用活病毒进行的中和方法进行比较，发现与活病毒的趋势一致，可以一定程度上反应活病毒的结果。制备类病毒颗粒时将新型冠状病毒膜蛋白的C端截断21个氨基酸可以显著提高类病毒滴度，且在进行假病毒滴定和中和试验中发现AF细胞(AF细胞为本实验室构建的将ACE2受体和Furin受体稳定转染的293T细胞)为敏感细胞系。所述方法能够应用于抗SARS
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2抗体或药物的筛选或者检测SARS
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2中和抗体的活性，为SARS
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2疫苗、药物评价、及病毒致病机制的研究提供了良好的技术支撑手段。
[0007]因此，在第一方面，本申请提供了一种SARS
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2类病毒颗粒的制备方法，所述方法包括将骨架质粒与膜质粒以2：1至3：1的比例转入宿主细胞中；其中，所述骨架质粒含有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，所述膜质粒含有如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。
[0008]在某些实施方案中，将所述骨架质粒与膜质粒通过瞬时转染或稳定转染至宿主细胞中。
[0009]在某些实施方案中，所述骨架质粒是将如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列插入pSG3
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env质粒所获得的。
[0010]在某些实施方案中，所述膜质粒是将如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列插入pcDNA3.1载体，并根据宿主细胞进行密码子优化所获得的。
[0011]在某些实施方案中，所述宿主细胞为人的细胞，例如，造血细胞，上皮细胞，肝细胞，肿瘤细胞，神经细胞；例如，293T细胞。
[0012]如前所述的方法，所述方法包括：将所述骨架质粒与所述膜质粒以2：1的比例通过Lipofilter转染试剂共转染293T细胞。
[0013]在某些实施方案中，将所述骨架质粒与所述膜质粒以2：1的比例通过Lipofilter转染试剂共转染293T细胞。
[0014]在另一方面，本申请提供了一种SARS
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2类病毒颗粒，其是通过如前所述的方法制备获得的。
[0015]在另一方面，本申请提供了一种筛选抗SARS
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2抗体或者检测SARS
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2抗体中和活性的方法，所述方法包括，在将如前所述的SARS
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CoV
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2类病毒颗粒与宿主细胞接触之前、同时或之后，将所述宿主细胞与所述抗体接触。
[0016]在某些实施方案中，方法包括：
[0017]步骤(i)：将如前所述的SARS
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CoV
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2类病毒颗粒与宿主细胞接触，然后，将所述宿主细胞与所述抗体接触。
[0018]步骤(ii)：在能够发出荧光的条件下，观察所述宿主细胞，以判断所述抗体是否是抗SARS
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CoV
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2的抗体；或者，在免疫斑点读板仪中对所述宿主细胞的阳性细胞数进行计数，并计算ID
50
值，以检测抗体的中和活性。
[0019]在另一方面，本申请提供了一种筛选能够抑制SARS
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CoV
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2感染细胞的候选药物的方法，所述方法包括，在将如前所述的SARS
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2类病毒颗粒与宿主细胞接触之前、同时或之后，将所述类病毒颗粒或宿主细胞与所述候选药物接触。
[0020]在某些实施方案中，将如前所述的SARS
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CoV
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2类病毒颗粒与宿主细胞接触，然后，将所述宿主细胞与所述抗体接触。
[0021]在某些实施方案中，方法包括：
[0022]步骤(i)：将如前所述的SARS
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CoV
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2类病毒颗粒与宿主细胞接触，然后，将所述宿主细胞与所述抗体接触。
[0023]步骤(ii)：在能够发出荧光的条件下，观察所述宿主细胞，以判断所述候选药物能否抑制SAR本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种SARS
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CoV
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2类病毒颗粒的制备方法，所述方法包括将骨架质粒与膜质粒以2：1至3：1的比例转入宿主细胞中；其中，所述骨架质粒含有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，所述膜质粒含有如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。2.权利要求1所述的方法，所述方法具有选自下列的一项或多项特征：(1)将所述的骨架质粒与膜质粒通过瞬时转染或稳定转染至宿主细胞中；(2)所述骨架质粒是将如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列插入pSG3
‑△
env质粒所获得的；(3)所述膜质粒是将如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列插入pcDNA3.1载体，并根据宿主细胞进行密码子优化所获得的；(4)所述宿主细胞为人的细胞，例如，造血细胞，上皮细胞，肝细胞，肿瘤细胞，神经细胞；例如，293T细胞。3.权利要求1或2所述的方法，所述方法包括：将所述骨架质粒与所述膜质粒以2：1的比例通过Lipofilter转染试剂共转染293T细胞。4.一种SARS
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2类病毒颗粒，其是通过权利要求1
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3任一项所述的方法制备获得的。5.一种筛选抗SARS
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2抗体或者检测SARS
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2抗体中和活性的方法，所述方法包括，在将权利要求4所述的SARS
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2类病毒颗粒与宿主细胞接触之前、同时或之后，将所述宿主细胞与所述抗体接触；优选地，方法包括：步骤(i)：将权利要求4所述的SARS
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2类病毒颗粒与宿主细胞接触，然后，将所述宿主细胞与所述抗体接触；步骤(ii)：在能够发出荧光的条件下，观察所述宿主细胞，以判断所述抗体是否是抗SARS
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2的抗体；或者，在免疫斑点读板仪中对所述宿主细胞的阳性细胞数进行计数，并计算ID
50
值，以检测抗体的中和活性。6.一种筛选能够抑制SARS
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CoV
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2感染细胞的候选药物的方法，所述方法包括，在将权利要求4所述的SARS
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CoV
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2类病毒颗粒与宿主细胞接触之前、同时或之后，将所述类病毒颗粒或宿主细胞与所述候选药物接触；优选地，方法包括：步骤(i)：将权利要求4所述的SARS
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CoV
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2类病毒颗粒与宿主细胞接触，然后，将所述宿主细胞与所述抗体接触；步骤(ii)：在能够发出荧光的条件下，观察所述宿主细胞，以判断所述候选药物能否抑制SARS
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2感染细胞。7.权利要求5或6所述的方法，其中，所述宿主细胞为人的细胞，例如，造血细...

【专利技术属性】
技术研发人员：王佑春，梁子腾，黄维金，聂建辉，张黎，
申请(专利权)人：中国食品药品检定研究院，
类型：发明
国别省市：