一种羊传染性脓疱病毒减毒株的制备方法及其应用技术

本发明专利技术提供了一种羊传染性脓疱病毒减毒株的制备方法，通过将目标基因突变的方式制备，所述目标基因为羊传染性脓疱病毒ORF120基因。所述缺失ORF120基因的羊传染性脓疱病毒是采用基因工程手段，利用同源重组的方法从ORFV

【技术实现步骤摘要】
一种羊传染性脓疱病毒减毒株的制备方法及其应用


[0001]本专利技术涉及兽医领域，具体涉及一种减毒的羊传染性脓疱病毒基因缺失株的制备方法及其应用。

技术介绍

[0002]羊传染性脓疱病俗称“羊口疮（Orf）”，是由羊传染性脓疱病毒（Orf virus, ORFV）感染引起绵羊、山羊等的一种急性、高度接触性的人兽共患传染病，临床以在感染部位形成丘疹、水疱、脓疱和疣状厚痂为特征。近年来，ORFV 感染的临床病例报道逐年增多，目前已呈世界范围分布。此外，ORFV在体外的生存能力较强，能够在环境中长期稳定地存在，羊群一旦被感染则很难清除，可持续多年对羊群造成危害。通过与病羊的直接/间接接触，人也可发生感染，尤其从事饲养、屠宰、兽医等职业的人员。因此，该病不仅对养羊业的危害较为突出，而且潜在危害人类健康，成为影响我国乃至世界公共卫生安全的一个重要隐患。
[0003]作为一种重要的人兽共患传染病病原，ORFV是如何突破天然免疫屏障成功感染宿主的具体机制至今尚不清楚，近年来针对ORFV感染与宿主免疫间关系受到越来越广泛的关注和深入的研究。研究发现，ORFV进化出了一系列拮抗/破坏宿主天然免疫的策略，可利用自身编码的多种免疫调节蛋白，通过抑制干扰素产生、细胞凋亡等多种机制来抑制和逃避宿主的抗病毒反应。然而，由于对ORFV诱导的宿主免疫和致病机制的研究仍不够深入，导致临床上尚缺乏有效的防治策略。
[0004]鉴于基因缺失减毒苗的构建依赖于对病毒毒力基因和免疫抑制相关基因的筛选鉴定以及对病毒致病机制的了解，近年来国内外研究人员对 ORFV全基因组序列及免疫逃避机制进行深入解析，分离和鉴定更多的免疫调节及毒力相关基因成为目前该领域研究的热点。
[0005]中国专利CN104017776B公开了通过传代培养获得致弱毒株并将其应用于疫苗的制备。通过传代获得的弱毒株由于其本身的基因并未发生改变，其病毒毒力存在复毒的风险。

技术实现思路

[0006]为了克服现有技术中的缺陷，本专利技术提供了一种羊传染性脓疱病毒减毒株的制备方法，通过将目标基因突变的方式制备，所述目标基因为羊传染性脓疱病毒ORF120基因。
[0007]羊传染性脓疱病毒为痘病毒科（Poxviridae）副痘病毒属（Parapoxvirus）的代表种，基因组庞大，由位于两末端的反向末端重复序列（ITRs）（ORFs 001
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008和112
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134）和中间核心区（ORFs 009
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111）构成，其中末端区ITRs集中有毒力免疫调节相关基因，能够编码产生使宿主防御反应的免疫成分失活的相关蛋白，如vIL
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10、趋化因子（MCP
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1、MIP
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1α、RANTES）阻遏蛋白（CBP）、GM
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CSF/IL
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2抑制因子（GIF）、抗细胞凋亡因子（ORFV125）和锚定蛋白（ANK）重复蛋白等，这些免疫调节因子被认为能够参与宿主免疫和炎症反应，通过与宿主体内一些免疫调节因子结合并降低其活性，抑制宿主的免疫反应从而促进病毒在宿主内的
生存和增殖。目前，针对ORFV基因组尤其是末端区部分未知功能的基因研究发现，ORFV002、ORFV024、ORFV073、ORFV121等基因编码蛋白为NF
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κB抑制剂，可通过多种途径阻断NF
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κB介导的天然免疫炎症信号通路，以拮抗宿主的天然免疫。其中，ORFV073、ORFV121既是免疫抑制基因又是毒力基因，然而ORFV编码的多个免疫抑制基因与病毒毒力并不相关，包括且不限于ORFV002 基因（DIEL D G, LUO S, DELHON G, et al. A Nuclear Inhibitor of NF
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κB Encoded by a Poxvirus [J]. Journal of virology, 2011, 85(1): 264
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75.）和ORFV024 基因（DIEL D G, DELHON G, LUO S, et al. A novel inhibitor of the NF
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{kappa}B signaling pathway encoded by the parapoxvirus orf virus [J]. Journal of virology, 2010, 84(8): 3962
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73.）均与病毒毒力无关，缺失ORFV002和ORFV024基因对病毒毒力及本源动物羊的致病性没有显著影响。目前，ORFV末端区仍有多个基因的功能未知，尚有待于挖掘。
[0008]本专利技术的研究工作中，优选采用ORFV
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SY17进行减毒毒株的制备。ORFV
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SY17的基因组序列已经公开于相关数据库。本专利技术首先从众多末端基因中锁定位于病毒基因组末端区的ORF120，然后通过大量序列信息的比对，确定ORFV
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SY17毒株的ORF120基因全长序列为ORFV
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SY17株基因组序列的120694至121281碱基的588bp核苷酸序列。进一步的研究，确定了缺失ORF120基因的ORFV
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SY17缺失株可在羊体内产生减毒表型，导致病毒毒力的减弱，证实ORF120基因是ORFV的一个重要毒力基因。为本专利技术进一步构建ORFV减毒株提供重要的理论依据。
[0009]本专利技术进一步的研究中，ORFV
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SY17病毒株基因组120779至121169基因位点的ORF120基因序列（如SEQ NO：2所示的核苷酸序列）的缺失导致野生病毒的减毒以及在本源动物羊等中小反刍动物上对亲本ORFV病毒攻击的100%免疫保护。因此，构建ORF120基因缺失病毒作为疫苗候选毒株更具有针对性。本专利技术优选的病毒野毒株ORFV
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SY17株为现有技术中已公开的毒株（Zhong J#, Guan J#, Zhou Y, Cui S, Wang Z, Zhou S, Xu M, Wei X, Gao Y, Zhai S, Song D, He W, Gao F, Zhao K*. Genomic characterization of two Orf virus isolates from Jilin province in China. Virus Genes, 2019, 55: 490
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501.），公众可通过与作者共享的方式获得。
[0010]优选的是，所述ORF120基因包含SEQ NO：1所示的核苷酸序列，ORF120基因的突变方式包括SEQ NO：1所示的核苷酸序列中第1～86至476～588位核苷酸序列的缺失或替换。优选的突变方式包括：SEQ NO：1所示的核苷酸序列中第1～476位核苷酸，第1～477位核苷酸，第1～478位核本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种羊传染性脓疱病毒减毒株的制备方法，通过将目标基因突变的方式制备，其特征在于，所述目标基因为羊传染性脓疱病毒ORF120基因。2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述ORF120基因包含SEQ NO：1所示的核苷酸序列，ORF120基因的突变方式包括SEQ NO：1所示的核苷酸序列中第1～86至476～588位核苷酸序列的缺失或替换；和/或SEQ NO：1所示的核苷酸序列中第86至476位核苷酸一个或多个碱基的缺失或替换。3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，ORF120基因的突变方式为SEQ NO：1所示的核苷酸序列中第86至476位核苷酸的缺失突变，缺失的核苷酸序列为SEQ NO：2所示的核苷酸序列。4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，在缺失突变位点插入第一标记基因。5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述羊传染性脓疱病毒为羊传染性脓疱病毒ORFV
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SY17株。6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，制备步骤包括：(1)准备亲本毒株：所述亲本毒株为羊传染性脓疱病毒ORFV
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SY17株，所述羊传染性脓疱病毒ORFV
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SY17株的全长基因序列如GenBank：MG712417.1所示。(2)筛选表达盒的构建：将适用于羊传染性脓疱病毒的特异性启动子和第一标记基因插入载体骨架中，获得筛选表达盒。(3)穿梭质粒的构建：扩增ORFV
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SY17株的ORF120基因缺失序列两侧的序列作为重组同源臂，克隆入步骤(2)构建的筛选表达盒上，获得标记后的重组穿梭质粒；(4...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵魁，周艳龙，关继羽，吕品，高丰，贺文琦，宋德光，兰云刚，李姿，田静，
申请(专利权)人：吉林大学，
类型：发明
国别省市：