一种区分感染和免疫的致弱流感病毒疫苗株及疫苗制造技术

本发明专利技术提供了一种区分感染和免疫的致弱流感病毒疫苗株及疫苗，属于生物制品技术领域。流感病毒致弱毒株在含A/B嵌合型NA基因的流感病毒株的基础上对M基因进行突变获得；所述突变包括在CCTCTC序列的3'端后缺失一段长度8bp以上的DNA片段。流感病毒致弱毒株在MDCK

【技术实现步骤摘要】
一种区分感染和免疫的致弱流感病毒疫苗株及疫苗


[0001]本专利技术属于生物制品
，具体涉及一种区分感染和免疫的致弱流感病毒疫苗株及疫苗。

技术介绍

[0002]流感病毒属于正黏病毒科单股负链分节段RNA病毒，根据抗原性不同可以分为A，B，C，D型四种类型。其中，A型流感病毒(IAV)普遍感染禽类动物，B型流感病毒(IBV)主要感染人和海豹。这两种类型病毒表面都含有血凝素酶(HA)和神经氨酸酶(NA)，HA负责识别和结合细胞表面唾液酸受体，帮助病毒入侵细胞，NA蛋白可以破坏HA和宿主细胞受体结合，帮助子代病毒释放。
[0003]如果引入B型NA与A型HA结合的重配疫苗株，则能够在血清学层面区分免疫和感染动物，目前，已经有研究使用A型流感病毒HA基因与嵌合B型流感病毒NA基因，利用反向遗传学技术生产区分感染和免疫的流感病毒疫苗株，然而，目前对于高致病性禽流感病毒，如H5、H7等亚型禽流感病毒，由于生产过程存在安全性隐患，禽流感灭活疫苗的培养与生产均需要BLS
‑
III级生产车间，大大增加了疫苗生产成本，阻碍了产业的发展。

技术实现思路

[0004]有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种流感病毒致弱毒株及其制备方法和应用，不需要在BLS
‑
III级生产车间制备，不仅大大降低生产成本而且杜绝生产过程中带来的生物安全风险；此外由本方法制备的禽流感灭活疫苗还具有区分感染和免疫动物的作用，有助于高致病性禽流感的防控和净化。
[0005]本专利技术提供了一种流感病毒致弱毒株，在含A/B嵌合型NA基因的流感病毒株的基础上对M基因进行突变获得；所述突变包括在CCTCTC序列的3'端后缺失一段长度8bp以上的DNA片段。
[0006]优选的，所述DNA片段的长度包括28～111bp。
[0007]优选的，所述DNA片段包括核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的第一DNA片段、核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示的第二DNA片段、核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示的第三DNA片段、核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示的第四DNA片段、核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示的第五DNA片段和核苷酸序列如SEQ ID NO:17所示的第六DNA片段。
[0008]优选的，所述突变还包括将CCTCTC序列突变为双终止密码子TGATGA。
[0009]优选的，所述A/B嵌合型NA基因是将A型流感病毒NA蛋白的胞外区序列替换为B型流感病毒NA蛋白的胞外区序列得到。
[0010]优选的，所述流感病毒株还包括突变的H5
‑
HA基因片段。
[0011]优选的，所述突变的H5
‑
HA基因片段为将HA的保守氨基酸序列SEQ ID NO:7突变为SEQ ID NO:8形成；
[0012]所述突变的H5
‑
HA基因片段中HA基因来自于流行株高致病毒株A/Duck/Hubei/49/
2005。
[0013]优选的，所述流感病毒株背景包括PR8病毒株。
[0014]本专利技术提供了所述流感病毒的制备方法，对流感病毒M基因的CCTCTC序列3
’
端后缺失一段8bp以上的DNA片段，构建得到Mdel缺陷型质粒；
[0015]利用经典的流感病毒6+2反向遗传系统，将所述Mdel缺陷型质粒、表达A/B嵌合型NA基因质粒与流感病毒其他基因双向表达质粒共转染细胞，收获病毒。
[0016]本专利技术提供了所述流感病毒致弱毒株在制备流感减毒疫苗中的应用。
[0017]本专利技术提供了所述流感病毒致弱毒株免疫产生的抗血清在制备区分免疫和自然感染的试剂中的应用。
[0018]本专利技术提供了一种流感病毒致弱毒株，在流感病毒株的基础上对M基因进行突变获得；所述突变包括在CCTCTC序列3'端后缺失一段长度8bp以上的DNA片段。对M基因的CCTCTC序列3'端后缺失一段不同长度的DNA片段，形成的流感病毒株仅在MDCK
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M2中可以正常生长，不能在MDCK细胞中生长，表明本专利技术获得的毒株具有明显致弱作用。同时，鸡胚生长实验表明，与野生型毒株相比，不同长度DNA片段的缺失使毒株的血凝价下降明显，甚至不能在鸡胚中正常生产，说明本专利技术获得的毒株具有明显的减毒效果。
[0019]进一步的，本专利技术限定了缺失不同长度DNA片段。结果表明，缺失的DNA片段的长度能够影响毒株的生长性能。缺失片段的长度会影响毒株在细胞以及鸡胚中的生长，缺失51bp、73bp、91bp和111bp长度的DNA片段时，与野生型毒株比较具有理想的生长特性和致弱作用。
[0020]进一步的，本专利技术还限定了将M基因的CCTCTC序列突变为双终止密码子TGATGA。突变为双终止密码子同时缺失其后的DNA片段，有利于毒株表现较强的致弱作用，并且有更明显的减毒效果。
[0021]本专利技术提供了所述流感病毒致弱毒株在制备流感减毒疫苗中的应用。将致弱病毒进行家禽免疫后，所述毒株能够在家禽体内产生较高水平的HAI抗体效价，这表明所述毒株能够用于制备灭活疫苗。同时由于流感病毒致弱毒株带有A/B嵌合型NA基因，A/B嵌合型NA基因作为标签序列，使制备的灭活疫苗免疫动物产生的阳性血清具有区分免疫和自然感染的能力。
[0022]本专利技术提供了所述流感病毒致弱毒株免疫产生的抗血清在制备区分免疫和自然感染的试剂中的应用。
附图说明
[0023]图1为本专利技术对M基因质粒的改造示意图；
[0024]图2为本专利技术构建的减毒流感重配株病毒在MDCK
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M2生长曲线；
[0025]图3为免疫荧光检测免疫鸡血清与A型以及B型NA蛋白的反应性。
具体实施方式
[0026]本专利技术提供了一种流感病毒致弱毒株，在含有A/B嵌合型NA基因的流感病毒株的基础上对M基因进行突变获得；所述突变包括在CCTCTC序列的3'端后缺失一段长度8bp以上的DNA片段。
[0027]在本专利技术中，所述M基因的核苷酸序列优选如SEQ ID NO:1所示。对M基因进行突变见图1。所述DNA片段的长度优选包括28～111bp，更优选包括73～91bp。所述DNA片段优选包括核苷酸序列如SEQ ID NO:2(ACTATTGCCGCAAATATCATTGGGATCT)所示的第一DNA片段、核苷酸序列如SEQ ID NO:3(ACTATTGCCGCAAATATCATTGGGATCTTGCACTTGACATTGTGGATTCTT)所示的第二DNA片段、核苷酸序列如SEQ ID NO:4(ACTATTGCCGCAAATATCATTGGGATCTTGCACTTGACATTGTGGATTCTTGATCGTCTTTTTTTCAAATGCA)所示的第三DNA片段、核苷酸序列如SEQ ID NO:5(ACTATTGCCGCAAATATCATTGGGATCTTGCACTTGACATTGTGGAT本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种流感病毒致弱毒株，其特征在于，在含A/B嵌合型NA基因的流感病毒株的基础上对M基因进行突变获得；所述突变包括在CCTCTC序列3'端后缺失一段长度8bp以上的DNA片段。2.根据权利要求1所述流感病毒致弱毒株，其特征在于，所述DNA片段的长度包括28～111bp。3.根据权利要求2所述流感病毒致弱毒株，其特征在于，所述DNA片段包括核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的第一DNA片段、核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示的第二DNA片段、核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示的第三DNA片段、核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示的第四DNA片段、核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示的第五DNA片段和核苷酸序列如SEQ ID NO:17所示的第六DNA片段。4.根据权利要求2所述流感病毒致弱毒株，其特征在于，所述突变还包括将CCTCTC序列突变为双终止密码子TGATGA。5.根据权利要求1所述流感病毒致弱毒株，其特征在于，所述A/B嵌合型NA基因是将A型流感病毒NA蛋白的胞外区序列替换为B型流感病毒NA蛋白的胞外区序列得到。6.根据权利要求1所述流感病毒致弱毒...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙慧敏，毛水花，余飞，简书令，宋家升，
申请(专利权)人：浙江迪福润丝生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：