本文提供了用于产生重组猪圆环病毒2型(PCV2)病毒样颗粒(VLP)的哺乳动物表达系统。该表达系统包括哺乳动物细胞和包含编码衣壳蛋白的PCV2基因的质粒。PCV2基因经密码子优化，并且用质粒转染哺乳动物细胞。表达系统产生重组PCV2 VLP，如PCV2d VLP。本文还提供了产生猪圆环病毒2型(PCV2)病毒样颗粒(VLP)的方法，以及通过该方法生成的PCV2 VLP。VLP。VLP。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】重组圆环病毒衣壳病毒样颗粒(VLP)：组合物、方法和用途
[0001]相关专利申请的交叉参考
[0002]本申请要求题为“重组圆环病毒衣壳病毒样颗粒(VLP)：组合物、方法 和用途(Recombinant Circovirus Capsid
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Virus
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Like Particle(VLP): Compositions,Methods and Uses)”的美国专利申请第62/837,758号的优先权 及其权益，其全部内容在此通过引用并入本文。
1.专利
[0003]本申请涉及包含猪圆环病毒
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2(PCV2)，且特别是PCV2病毒样颗粒 (VLP)的组合物。
[0004]2.专利技术背景
[0005]圆环病毒是小的无包膜二十面体病毒，包含一个小的圆形共价闭合的单 链DNA(ssDNA)基因组。圆环病毒已在多种物种中得到鉴定，并且已知会导 致禽鸟、水生动物和陆生动物的感染(1，2)。近年来，衣壳形态和基因组组 构的变化导致将圆环病毒科(Circoviridae)分为两个独立的属，圆环病毒 (Circovirus)和环病毒(Cyclovirus)(3)。圆环病毒属包括猪圆环病毒1(PCV1)、 2(PCV2)和3(PCV3)(2)。与环病毒属相关的基因组序列已与一些脊椎动物和 无脊椎动物物种相关联，但是这组病毒的终宿主的鉴别仍不清楚(2)。作为猪 圆环病毒相关疾病(PCVAD)的病原体，PCV2感染是导致猪显著病死率的原 因，并且还与猪皮炎肾病综合征(PDNS)以及猪生殖障碍有关(1，4)。
[0006]所述病毒颗粒直径约为19nm，PCV基因组的大小范围为1.7kb至2.3kb。 所述基因组的圆环性质导致所述病毒家族被命名为圆环病毒。已经探索了进 化历史，并可以描述详细的系统发育树和衣壳表面结构的变化(5
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8)。几种天 然圆环病毒的初始低温电子显微镜(cryo
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EM)图像重建表明所述衣壳具有 T＝1二十面体对称性(9)。PCV基因组编码一种结构衣壳蛋白(CP)。来自大肠 杆菌的PCV2b CP蛋白的表达和纯化被证明自组装及模拟70种感染性病毒 的整体形态。这种病毒样颗粒(VLP)的晶体结构将CP折叠可视化为由两个四 链β折叠组成的经典病毒胶冻卷(10，11)。连接β链的环形成病毒表面的特 征，可以包括抗原表位。PCV2b CP也从粉纹夜蛾(Trichoplasia ni)昆虫细胞 中表达和纯化为VLP(11)。这种VLP的低温电子显微镜图像重建表明N末 端位于衣壳内部，作者推断与N末端相关的抗原性性质可以是N末端从衣 壳瞬时外化的结果，这是被称为病毒“呼吸”的过程(11
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13)。N末端的外化 在病毒的生命周期中可以发挥重要作用。
[0007]GenBank中PCV2条目的氨基酸序列已分为四种不同的基因型(PCVa
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d) (14)。PCV2a是主要的全球基因型，直到2003年观察到基因型转变为 PCV2b(15，16)。PCV2c基因型可以已经灭绝，因为GenBank中只有三个保 藏物。在2013年，Wei等人报告及在GenBank中保藏了大量PCV2d序列(5)。 其它的PCV2d序列报告和保藏导致GenBank中大约320个保藏物中的84 个保藏物(7)。PCV2d序列保藏的增加可以是PCV2d在亚洲、欧洲、北美州 和南美州成为新兴和主要基因型的结果。所述增加可以是疫苗接种的逃逸突 变体的结果(17)。因此，PCV2d可以代表第二次全球基因型转变，其对于目 前针对PCV2的疫苗接种计划无反应(7)。
尽管对PCV2基因型进行了大量的 系统发育研究，并且PCV2d在全球养猪业中的重要性日益凸显，但没有描 述PCV2d衣壳结构的报告。
[0008]鉴于PCV2d的涌现，需要更深入地了解PCV2基因型及其差异，以开 发针对这些类型病毒引起的疾病的治疗方法。本专利技术申请解决了这些和其它 问题。
[0009]3.专利技术概述
[0010]在第一方面，提供了用于产生重组猪圆环病毒2型(PCV2)病毒样颗粒 (VLP)的哺乳动物表达系统。表达系统包含哺乳动物细胞和包含编码衣壳蛋 白的PCV2基因的质粒。PCV2基因经密码子优化，且用质粒转染哺乳动物 细胞。表达系统产生重组PCV2 VLP。
[0011]另一方面，哺乳动物细胞是人胚胎肾293(HEK
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293)哺乳动物细胞。
[0012]另一方面，PCV2基因包括NheI的识别位点、Kozak序列和NotI的识 别位点。NheI的识别位点和Kozak序列位于PCV2基因的起始密码子的上 游，且NotI识别位点掺入PCV2基因的终止密码子之后。
[0013]另一方面，产生的重组PCV2 VLP的大部分存在于哺乳动物细胞的核中。
[0014]另一方面，衣壳蛋白包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列。另一方面，衣 壳蛋白由SEQ ID NO:1的核苷酸序列编码。
[0015]另一方面，衣壳蛋白用分泌信号序列修饰，所述分泌信号序列在衣壳蛋 白的NH2端处引入。进一步的方面，衣壳蛋白包含SEQ ID NO:4的氨基酸 序列。进一步的方面，衣壳蛋白由SEQ ID NO:3的核苷酸序列编码。
[0016]另一方面，产生的重组PCV2 VLP选自下组：PCV2a VLP、PCV2b VLP、 PCV2c VLP、PCV2d VLP和PCV2e VLP。进一步的方面，产生的重组PCV2 VLP是PVC2d VLP。
[0017]另一方面，质粒是pcDNA3.4
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PCV2。另一方面，使用图1A的经密码子 优化的氨基酸序列对PCV2基因进行密码子优化。
[0018]在第二方面，提供了用于产生猪圆环病毒2型(PCV2)病毒样颗粒(VLP) 的方法。在方法中，提供了培养的哺乳动物细胞的悬浮液。将哺乳动物细胞 用包含编码衣壳蛋白的PCV2基因的质粒转染。将丙戊酸(VPA)钠盐添加至 经转染的哺乳动物细胞，并且VPA钠盐的添加抑制细胞增殖。将经转染的 哺乳动物细胞离心并洗涤。然后将离心的哺乳动物细胞悬浮在磷酸盐缓冲盐 水(PBS)溶液中。对哺乳动物细胞进行多次冷冻和解冻循环，然后在多次循 环中对哺乳动物细胞进行超声处理。然后对哺乳动物细胞进行两个连续离心 循环以产生PCV2 VLP，并且产生的PCV2 VLP的大部分存在于哺乳动物细 胞的核中。
[0019]在方法的另一方面，对转染的哺乳动物细胞进行离心和洗涤的步骤包括： 将哺乳动物细胞以2,000
×
g离心15分钟，用PBS溶液洗涤哺乳动物细胞， 并再次以2,000
×
g将哺乳动物细胞离心15分钟。
[0020]在方法的另一方面，在冷冻和解冻循环期间，离心的哺乳动物细胞在大 约
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80℃冷冻及在大约37℃解冻。
[0021]在方法本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.用于产生重组猪圆环病毒2型(PCV2)病毒样颗粒(VLP)的哺乳动物表达系统，所述表达系统包含：哺乳动物细胞；包含编码衣壳蛋白的PCV2基因的质粒，其中所述PCV2基因经密码子优化；其中用所述质粒转染所述哺乳动物细胞；并且其中所述表达系统产生重组PCV2 VLP。2.权利要求1的表达系统，其中所述哺乳动物细胞是人胚胎肾293(HEK
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293)哺乳动物细胞。3.权利要求1至2的表达系统，其中所述PCV2基因包括NheI的识别位点、Kozak序列和NotI的识别位点，并且其中所述NheI的识别位点和所述Kozak序列位于所述PCV2基因的起始密码子的上游，并且所述NotI的识别位点掺入所述PCV2基因的终止密码子之后。4.权利要求1至3的表达系统，其中所述产生的重组PCV2 VLP的大部分存在于所述哺乳动物细胞的核中。5.权利要求1至4的表达系统，其中所述衣壳蛋白包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列。6.权利要求1至5的表达系统，其中所述衣壳蛋白由SEQ ID NO:1的核苷酸序列编码。7.权利要求1至4的表达系统，其中用分泌信号序列修饰所述衣壳蛋白，所述分泌信号序列在所述衣壳蛋白的NH2端处引入。8.权利要求7的表达系统，其中所述衣壳蛋白包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列。9.权利要求7至8的表达系统，其中所述衣壳蛋白由SEQ ID NO:3的核苷酸序列编码。10.权利要求1至9的表达系统，其中所述产生的重组PCV2 VLP选自下组：PCV2a VLP、PCV2b VLP、PCV2c VLP、PCV2d VLP和PCV2e VLP。11.权利要求1至10的表达系统，其中所述产生的重组PCV2 VLP是PVC2d VLP。12.权利要求1至11的表达系统，其中所述质粒是pcDNA3.4
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PCV2。13.权利要求1至12的表达系统，其中使用图1A的密码子优化的氨基酸序列对所述PCV2基因进行密码子优化。14.用于产生猪圆环病毒2型(PCV2)病毒样颗粒(VLP)的方法，其包括：提供培养的哺乳动物细胞的悬浮液；用包含编码衣壳蛋白的PCV2基因的质粒转染所述哺乳动物细胞；将丙戊酸(VPA)钠盐添加至经转染的哺乳动物细胞...
【专利技术属性】
技术研发人员：JM加拉扎，K温，B加夫里洛夫，
申请(专利权)人：浩卫制药公司，
类型：发明
国别省市：
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