重组经典猪瘟病毒制造技术

本发明专利技术涉及动物健康领域。具体地，本发明专利技术涉及在由6B8单克隆抗体特异性识别的E2蛋白的表位内包含至少一个取代的重组经典猪瘟病毒。另外，本发明专利技术提供了包含本发明专利技术的CSFV的免疫原性组合物以及该免疫原性组合物用于预防和/或治疗动物中与CSFV相关的疾病的用途。此外，本发明专利技术提供了用于使CSFV感染的动物与用本发明专利技术的免疫原性组合物接种的动物区分开的方法或试剂盒。本发明专利技术还提供了减毒经典猪瘟病毒。本发明专利技术还提供了减毒经典猪瘟病毒。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】重组经典猪瘟病毒


[0001]本专利技术涉及动物健康领域。具体地，本专利技术涉及在E2蛋白的6B8表位内包含至少一个突变的重组经典猪瘟病毒，其中(未经修饰的)6B8表位被6B8单克隆抗体特异性识别。另外，本专利技术提供了包含本专利技术的重组CSFV的免疫原性组合物以及该免疫原性组合物用于预防和/或治疗动物中与CSFV相关的疾病的用途。此外，本专利技术提供了用于使CSFV感染的动物与用本专利技术的免疫原性组合物接种(vaccinate)的动物区分开的方法和试剂盒。

技术介绍

[0002]经典猪瘟(CSF)是一种会造成重大经济损失的猪和野猪的高度传染性疾病。该疾病的病原体是经典猪瘟病毒(CSFV)。在中国，实施预防性疫苗接种与扑杀策略的组合以控制CSF暴发。然而，在中国的大部分地区仍有散发性CSF暴发和持续性感染的报道。
[0003]目前可用的CSFV疫苗基于C株，其已经通过在兔中连续传代而减毒并且已证明针对CSF安全且有效。在疫苗接种后5天内引发较强的免疫应答，这提供了可靠的保护。然而，局限性之一在于被野毒株感染的动物不能与通过标准血清学方法疫苗接种的那些区分开。
[0004]本领域仍然需要一种新的CSFV疫苗，该疫苗安全、有效，并且用其接种的动物能够与野生型野毒株感染的那些区分开来。

技术实现思路

[0005]在一个方面，本专利技术提供了在E2蛋白的6B8表位内包含至少一个突变的重组CSFV(经典猪瘟病毒)，其中(未经修饰的)6B8表位由6B8单克隆抗体特异性识别，并且其中6B8单克隆抗体由以保藏号CCTCC C2018120保藏在CCTCC的杂交瘤产生，或者其中6B8单克隆抗体包含具有如SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列的重链可变区(V
H
)以及具有如SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列的轻链可变区(V
L
)，或者其中6B8单克隆抗体包含由以保藏号CCTCC C2018120保藏在CCTCC的杂交瘤产生的单克隆抗体的CDR，或者其中6B8单克隆抗体包含含有SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列的VH CDR1、含有SEQ ID NO:26所示的氨基酸序列的VH CDR2、含有SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列的VH CDR3、含有SEQ ID NO:28所示的氨基酸序列的VL CDR1、含有SEQ ID NO:29所示的氨基酸序列的VL CDR2，以及含有SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列的VL CDR3。
[0006]在一个方面，本专利技术提供了减毒CSFV，其可以包含或可以不包含如本文所公开的E2蛋白的6B8表位内的一个或多个突变。在一个方面，本专利技术提供了减毒CSFV，其具有引起减毒的Erns蛋白内的至少一个突变和/或Npro蛋白内的突变。优选地，Erns蛋白内的突变是氨基酸位置79的缺失和/或氨基酸位置171的缺失，并且Npro内的突变是Npro蛋白除前四个氨基末端氨基酸之外的缺失。在一个方面，本专利技术提供了减毒CSFV，其具有如本文所公开的引起减毒的Erns蛋白内的至少一个突变和/或Npro蛋白内的突变，以及如本文所提供的E2蛋白的6B8表位内的突变。在一个方面，在可以包含或可以不包含如本文所公开的E2蛋白的6B8表位内的一个或多个突变的根据本专利技术的减毒CSFV衍生自C株或者野毒株QZ07或GD18。
[0007]在一个方面，本专利技术提供了编码本专利技术的重组CSFV的分离的核酸。
[0008]在一个方面，本专利技术提供了包含本专利技术的核酸的载体。
[0009]在一个方面，本专利技术提供了包含根据本专利技术的重组CSFV的免疫原性组合物。
[0010]在一个方面，本专利技术提供了预防和/或治疗动物中与CSFV相关的疾病的方法，该方法包括将本专利技术的免疫原性组合物施用于有此需要的动物的步骤。
[0011]在一个方面，本专利技术提供了标记CSFV疫苗的方法，该方法包括在CSFV中引入E2蛋白的6B8表位内的至少一个突变，其中(未经修饰的)6B8表位由6B8单克隆抗体特异性识别，并且其中6B8单克隆抗体由以保藏号CCTCC C2018120保藏在CCTCC的杂交瘤产生，或者其中6B8单克隆抗体包含具有如SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列的重链可变区(V
H
)以及具有如SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列的轻链可变区(V
L
)，或者其中6B8单克隆抗体包含由以保藏号CCTCC C2018120保藏在CCTCC的杂交瘤产生的单克隆抗体的CDR，或者其中6B8单克隆抗体包含含有SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列的VH CDR1、含有SEQ ID NO:26所示的氨基酸序列的VH CDR2、含有SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列的VH CDR3、含有SEQ ID NO:28所示的氨基酸序列的VL CDR1、含有SEQ ID NO:29所示的氨基酸序列的VL CDR2，以及含有SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列的VL CDR3。
[0012]在一个方面，本专利技术提供了使CSFV感染的动物与用本专利技术的免疫原性组合物接种的动物区分开的方法，该方法包括a)从动物获得样品；以及b)在免疫测试中分析所述样品。
[0013]在一个方面，本专利技术提供了抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体由以保藏号CCTCC C2018120保藏在CCTCC的杂交瘤产生，或者其中所述抗体包含具有如SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列的重链可变区(V
H
)以及具有如SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列的轻链可变区(V
L
)，或者其中所述抗体包含由以保藏号CCTCC C2018120保藏在CCTCC的杂交瘤产生的单克隆抗体的CDR，或者其中所述抗体包含含有SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列的VH CDR1、含有SEQ ID NO:26所示的氨基酸序列的VH CDR2、含有SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列的VH CDR3、含有SEQ ID NO:28所示的氨基酸序列的VL CDR1、含有SEQ ID NO:29所示的氨基酸序列的VL CDR2，以及含有SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列的VL CDR3。
[0014]在一个方面，本专利技术提供了用于使CSFV感染的动物与用本专利技术的免疫原性组合物接种的动物区分开的试剂盒，其包含本专利技术的抗体或其抗原结合片段。
附图说明
[0015]图1：具有双缺失或单缺失的减毒候选病毒的生长特征。
[0016]图2：mAb 6B8识别大多数CSFV毒株，而与BVDV病毒无反应。
[0017]图3：CSFV分离株、BVDV毒株和一些其他瘟病毒属的序列比对。
[0018]图4：IFA结果示出了位置14、22、或24/25处的氨基酸残基对于mAb 6B8结合是至关重要的。
[0019]图5：具有各种DIVA突变的GD18
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ddNpro
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ErnsH的拯救病毒的IFA结果。...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种重组CSFV(经典猪瘟病毒)，其在E2蛋白的6B8表位内包含至少一个突变，其中未经修饰的6B8表位被6B8单克隆抗体特异性识别。2.根据权利要求1所述的重组CSFV，其中所述E2蛋白的6B8表位内的所述至少一个突变导致6B8单克隆抗体与此突变的6B8表位的结合受到特异性抑制。3.根据权利要求1或2所述的重组CSFV，其中所述6B8单克隆抗体i)由以保藏号CCTCC C2018120保藏在CCTCC的杂交瘤产生，或者ii)包含具有如SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列的重链可变区(V
H
)以及具有如SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列的轻链可变区(V
L
)，或者iii)包含由以保藏号CCTCC C2018120保藏在CCTCC的杂交瘤产生的单克隆抗体的CDR，或者iv)包含含有SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列的VH CDR1、含有SEQ ID NO:26所示的氨基酸序列的VH CDR2、含有SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列的VH CDR3、含有SEQ ID NO:28所示的氨基酸序列的VL CDR1、含有SEQ ID NO:29所示的氨基酸序列的VL CDR2，以及含有SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列的VL CDR3。4.根据权利要求1至3中任一项所述的重组CSFV，其中所述6B8单克隆抗体特异性识别的所述E2蛋白的6B8表位至少由所述E2蛋白的位置14、位置22、位置24和/或位置24/25处的氨基酸残基限定。5.根据权利要求1至3中任一项所述的重组CSFV，其中所述6B8单克隆抗体特异性识别的所述E2蛋白的6B8表位至少由所述E2蛋白的氨基酸残基S14、G22、E24和/或E24/G25限定，或者至少由所述E2蛋白的氨基酸残基S14、G22、G24和/或G24/G25限定。6.根据权利要求1至3中任一项所述的重组CSFV，其中所述6B8单克隆抗体特异性识别的所述E2蛋白的6B8表位至少由氨基酸序列STNEIGPLGAEG或STDEIGLLGAGG限定。7.根据权利要求1至6中任一项所述的重组CSFV，其包含所述E2蛋白的氨基酸位置24处的取代、所述E2蛋白的氨基酸位置24/25处的取代、所述E2蛋白的氨基酸位置14处的取代，和/或所述E2蛋白的氨基酸位置22处的取代。8.根据权利要求1至7中任一项所述的重组CSFV，其中所述E2蛋白的位置24处的氨基酸被取代为R或K，所述E2蛋白的位置24/25处的氨基酸被取代为R/D或K/D，所述E2蛋白的位置14处的氨基酸被取代为K、Q或R，和/或所述E2蛋白的位置22处的氨基酸被取代为A、R、Q或E(其中A和R是优选的)。9.根据权利要求1至8中任一项所述的重组CSFV，其包含所述E2蛋白的氨基酸位置24处的E或G至R或K的取代、氨基酸位置24处的E或G至R或K的取代和所述E2蛋白的氨基酸位置25处的G至D的取代、所述E2蛋白的氨基酸位置14处的S至为K、Q或R的取代，和/或所述E2蛋白的氨基酸位置22处的G至A、R、Q或E(其中A和R是优选)的取代。10.根据权利要求1至9中任一项所述的重组CSFV，其中所述E2蛋白的6B8表位内的氨基酸取代导致如SEQ ID No:13
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14、31
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34中任一项所示的突变的6B8表位序列。11.根据权利要求1至10中任一项所述的重组CSFV，其中所述重组CSFV是减毒的。12.根据权利要求1至11中任一项所述的重组CSFV，其中所述重组CSFV具有Erns蛋白中的至少一个突变和/或Npro蛋白中的至少一个突变；优选地所述Erns蛋白中的此类突变是Erns蛋白的氨基酸位置79处的氨基酸缺失和/或Erns蛋白的氨基酸位置171处的氨基酸缺
失，并且Npro蛋白中的所述突变是所述Npro蛋白除前四个氨基末端氨基酸之外的缺失。13.根据权利要求1至12中任一项所述的重组CSFV，其中所述重组CSFV衍生自C株或者野毒株QZ07、GD191或GD18。14.根据权利要求1至13中任一项所述的重组CSFV，其中所述重组CSFV衍生自野毒株QZ07，并且(i)包含Erns蛋白的氨基酸位置79处的氨基酸缺失，以及(ii)包含所述E2蛋白的氨基酸位置24处的E至R或K的取代、或者氨基酸位置24处的E至R或K的取代和所述E2蛋白的氨基酸位置25处的G至D的取代，并且任选地还包含所述E2蛋白的氨基酸位置14处的S至K、Q或R的取代，和/或所述E2蛋白的氨基酸位置22处的G至A、R、Q或E(其中A和R是优选的)的取代。15.根据权利要求1至13中任一项所述的重组CSFV，其中所述重组CSFV衍生自野毒株QZ07，并且(i)包含Erns蛋白的氨基酸位置79处的氨基酸缺失、Erns蛋白的氨基酸位置171处的氨基酸缺失，(ii)包含所述E2蛋白的氨基酸位置24处的E至R或K的取代、或者氨基酸位置24处的E至R或K的取代和所述E2蛋白的氨基酸位置25处的G至D的取代，并且任选地还包含所述E2蛋白的氨基酸位置14处的S至K、Q或R的取代，和/或所述E2蛋白的氨基酸位置22处的G至A、R、Q或E(其中A和R是优选的)的取代。16.根据权利要求1至13中任一项所述的重组CSFV，其中所述重组CSFV衍生自野毒株GD18，并且(i)包含Erns蛋白的氨基酸位置79处的氨基酸缺失、所述Npro蛋白除前四个氨基末端氨基酸之外的缺失，以及(ii)包含所述E2蛋白的氨基酸位置24处的E至R或K的取代、或者氨基酸位置24处的E至R或K的取代和所述E2蛋白的氨基酸位置25处的G至D的取代，并且任选地还包含所述E2蛋白的氨基酸位置14处的S至K、Q或R的取代，和/或所述E2蛋白的氨基酸位置22处的G至A、R、Q或E(其中A和R是优选的)的取代。17.根据权利要求1至13中任一项所述的重组CSFV，其中所述重组CSFV衍生自野毒株GD18，并且(i)包含Erns蛋白的氨基酸位置79处的氨基酸缺失、Erns蛋白的氨基酸位置171处的氨基酸缺失，以及(ii)包含所述E2蛋白的氨基酸位置24处的E至R或K的取代、或者氨基酸位置24处的E至R或K的取代且所述E2蛋白的氨基酸位置25处的G至D的取代，并且任选地还包含所述E2蛋白的氨基酸位置14处的S至K、Q或R的取代，和/或所述E2蛋白的氨基酸位置22处的G至A、R、Q或E(其中A和R是优选的)的取代。18.一种分离的核酸，其编码根据权利要求1至17中任一项所述的重组CSFV。19.一种载体，其包含根据权利要求18所述的核酸。20.一种免疫原性组合物，其包含根据权利要求1至16中任一项所述的重组CSFV、编码根据权利要求17所述的重组CSFV的分离的核酸、或根据权利要求19所述的载体。21.根据权利要求20所述的免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物是标记疫苗或
DIVA(区分感染的和疫苗接种的动物)疫苗。22.根据权利要求20或21所述的免疫原性组合物，其用于在预防和/或治疗动物中与CSFV相关的疾病的方法中，所述方法包括将根据权利要求20或21所述的免疫原性组合物施用于有此需要的动物的步骤。23.一种预防和/或治疗动物中与CSFV相关的疾病的方法，所述方法包括将根据权利要求20或21所述的免疫原性组合物施用于有此需要的动物的步骤。24.一种制备CSFV疫苗的方法，其包括在CSFV中引入由6B8单克隆抗体特异性识别的E2蛋白的6B8表位内的至少一个突变。25.根据权利要求24所述的方法，其中所述6B8单克隆抗体i)由以保藏号CCTCC C2018120保藏在CCTCC的杂交瘤产生，或者ii)包含具有如SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列的重链可变区(V
H
)以及具有如SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列的轻链可变区(V
L
)，或者iii)包含由以保藏号CCTCC C2018120保藏在CCTCC的杂交瘤产生的单克隆抗体的CDR，或者iv)包含含有SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列的VH CDR1、含有SEQ ID NO:26所示的氨基酸序列的VH CDR2、含有SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列的VH CDR3、含有SEQ ID NO:28所示的氨基酸序列的VL CDR1、含有SEQ ID NO:29所示的氨基酸序列的VL CDR2，以及含有SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列的VL CDR3。26.根据权利要求24或25所述的...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈宁，蒋晓虹，刘欢欢，童超，王佳莹，
申请(专利权)人：勃林格殷格翰动物保健中国有限公司，
类型：发明
国别省市：