一种羊传染性脓疱病毒减毒株的制备方法及其应用技术

本发明专利技术提供了一种羊传染性脓疱病毒减毒株的制备方法，将羊传染性脓疱病毒毒力基因突变失活，所述毒力基因突变为ORFs 120/121双基因突变。缺失ORFs 120/121基因后ORFV的致病性显著降低。本发明专利技术通过敲除ORFV

【技术实现步骤摘要】
一种羊传染性脓疱病毒减毒株的制备方法及其应用


[0001]本专利技术涉及兽医领域，具体涉及一种荧光标记的羊传染性脓疱病毒双基因缺失毒株的制备方法及其应用。

技术介绍

[0002]羊传染性脓疱病俗称“羊口疮(Orf)”，是由羊传染性脓疱病毒(Orf virus,ORFV)感染引起绵羊、山羊等的一种急性、高度接触性的人兽共患传染病。该病是羊群常发疫病，主要危害3～6月龄羔羊，造成其生长/繁殖性能的下降甚至死亡，给我国乃至世界养羊业造成严重的经济损失。由于ORFV体外生存能力强，羊群一旦发生感染很难进行清除，可持续多年对羊群造成危害。因此，该病不仅对养羊业的危害较为突出，从事饲养、屠宰、兽医等职业的从业人员也常发生感染，对全球公共卫生安全也带来了严峻挑战。
[0003]目前尚无有效的特异性药物用于羊传染性脓疱病的治疗，疫苗接种仍然是预防和控制该病的重要措施，尽管针对ORFV疫苗研究也取得了积极的进展，但常规的灭活疫苗和弱毒疫苗存在的缺陷，使得疫苗的安全性和免疫保护效果尚待提高。因此急需开展安全有效的羊传染性脓疱病疫苗的创新，这对于羊传染性脓疱病的防治至关重要。
[0004]天然免疫是宿主抵御病原微生物入侵的第一道防线，在宿主抗病毒反应中发挥重要作用。ORFV是痘病毒科、副痘病毒属的代表种，基因组庞大，编码蛋白种类众多，研究发现，ORFV在长期进化过程中可通过末端基因组编码的多种免疫调节蛋白来拮抗宿主的天然免疫以利于自身的存活。此外，ORFV末端区的这些免疫调节基因也多为毒力相关基因，这些毒力基因的存在导致当前常规灭活疫苗的毒性作用大于预防效果，存在一定的安全隐患。当前，毒力基因缺失减毒疫苗是新型疫苗研究的一个热点，而构建、筛选及鉴定ORFV免疫调节/毒力基因缺失毒株将为后期羊传染性脓疱病毒基因缺失减毒活疫苗的研发提供重要的物质基础。
[0005]减毒活疫苗不仅具有有效诱导机体产生细胞免疫、体液免疫及黏膜免疫等优点，同时越来越多毒力基因的成功挖掘使得减毒疫苗的安全性能够获得保障，因此，安全有效的ORFV基因缺失减毒疫苗是未来开展新型、高效疫苗研发的一个重要方向，有望在羊传染性脓疱病防控中发挥重要作用。本专利技术选择ORFV基因组右末端的ORFs 120/121基因作为毒力基因敲除靶标，利用经典的同源重组技术成功构建ORFV
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SY17ΔORFs 120/121
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eGFP双基因缺失减毒株，其不仅具有作为制备羊传染性脓疱病基因缺失减毒活疫苗生产毒株的潜在应用价值，而且临床上可用于鉴别和诊断人工免疫羊和自然感染羊，有利于建立ORFV疫苗毒和野毒检测的鉴别诊断方法。

技术实现思路

[0006]本专利技术针对羊传染性脓疱病疫苗缺乏和已知疫苗的有效性不理想的现状，提供了一种荧光标记的羊传染性脓疱病毒(ORFV)ORFs 120/121双基因缺失毒株的构建方法，所述缺失ORFs120/121基因的毒株(ORFV
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SY17ΔORFs 120/121
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eGFP)是利用同源重组技术，从
ORFV
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SY17野毒株中敲除ORFs 120/121基因，并以绿色荧光蛋白(eGFP)基因作为筛选标记，以达到进一步减毒、降低生物安全风险的目的。该毒株减毒效果明显，与单独缺失ORF120基因相比，ORF120与ORF121基因序列进行联合缺失，进一步降低毒力。本专利技术提供的减毒株制备方法得到的减毒株，其安全性能良好，可潜在作为制备羊传染性脓疱病基因缺失减毒活疫苗的生产毒株，为新型疫苗研发提供候选毒株。将制备的ORFV
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SY17ΔORFs 120/121
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eGFP缺失毒株免疫本源动物羔羊，可提供对羊传染性脓疱病毒流行毒株100％免疫保护，有望作为安全、有效防控羊传染性脓疱病的疫苗，是一种具有良好发展应用前景的疫苗候选株。
[0007]进一步的本专利技术提供了一种鉴别上述缺失ORFs 120/121基因的羊传染性脓疱病毒减毒株与野毒株鉴别的引物对，同时缺失的ORFs 120/121基因也可作为标志基因，建立用于ORFV疫苗毒和野毒检测的鉴别诊断方法。
[0008]本专利技术建立羊传染性脓疱病毒基因缺失减毒疫苗毒株的构建方法，用于筛选安全、有效的疫苗候选毒株。
[0009]本专利技术提供了一种羊传染性脓疱病毒减毒株的制备方法，将羊传染性脓疱病毒毒力基因突变失活，所述毒力基因突变为ORFs 120/121双基因突变。
[0010]优选的是，所述毒力基因突变ORFs 120/121双基因缺失突变。
[0011]上述任一项优选的是，所述羊传染性脓疱病毒为羊传染性脓疱病毒ORFV
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SY17株，全长基因序列如GenBank：MG712417.1所述。
[0012]上述任一项优选的是，缺失的ORFs 120/121基因序列包括如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
[0013]上述任一项优选的是，所述ORFs 120/121双基因缺失突变为ORFV
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SY17株全长序列的120779至122185位核苷酸缺失突变。
[0014]上述任一项优选的是，具体包括以下步骤：
[0015]步骤1：准备亲本毒株，所述亲本毒株为羊传染性脓疱病毒ORFV
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SY17株，全长基因序列如GenBank：MG712417.1所述；
[0016]步骤2：同源重组穿梭质粒的构建：分别扩增ORFV
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SY17株的ORFs 120/121基因两侧的序列作为重组同源臂，克隆至pUC57
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vvp7.5
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eGFP筛选表达盒上，获得携带标记基因eGFP的pUC57
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LFΔORFs120/121
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eGFP
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RFΔORFs 120/121重组穿梭质粒；通过步骤2，在基因缺失的部位通过同源重组插入绿色荧光蛋白基因(eGFP)作为标记物，具有同等作用的荧光素DsRED,RFP,mCherry,tdTomato,YFP均可作为筛选标记。
[0017]步骤3：利用步骤2制备的pUC57
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LFΔORFs 120/121
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eGFP
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RFΔORFs 120/121质粒DNA转染已感染ORFV
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SY17野毒株的OFTu细胞，通过荧光斑法和有限稀释法获得表达绿色荧光蛋白的缺失病毒ORFV
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SY17ΔORFs 120/121
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eGFP；
[0018]步骤4：将ORFV
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SY17ΔORFs 120/121
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eGFP作为候选毒株，敲除GFP，制备得到羊传染性脓疱病毒ORFs120/121双基因缺失毒株。
[0019]上述任一项优选的是，ORFs 120/121基因两侧的左、右重组同本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种羊传染性脓疱病毒减毒株的制备方法，将羊传染性脓疱病毒毒力基因突变失活，其特征在于，所述毒力基因突变为ORFs 120/121双基因突变。2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述毒力基因突变ORFs 120/121双基因缺失突变。3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述羊传染性脓疱病毒为羊传染性脓疱病毒ORFV
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SY17株。4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，缺失的ORFs 120/121基因序列包括如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述ORFs 120/121双基因缺失突变为ORFV
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SY17株全长序列的120779至122185位核苷酸缺失突变。6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，具体包括以下步骤：步骤1：准备亲本毒株，所述亲本毒株为羊传染性脓疱病毒ORFV
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SY17株，全长基因序列如GenBank：MG712417.1所述；步骤2：同源重组穿梭质粒的构建：分别扩增ORFV
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SY17株的ORFs 120/121基因两侧的序列作为重组同源臂，克隆至pUC57
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vv7.5
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eGFP筛选表达盒上，获得携带标记基因eGFP的pUC57
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LFΔORFs120/121
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eGFP
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RFΔORFs 120/...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵魁，王帅，何师师，方梓煜，周艳龙，关继羽，陆慧君，吕品，徐梦实，贺文琦，高丰，
申请(专利权)人：吉林大学，
类型：发明
国别省市：