一种冠状病毒致弱突变株及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种冠状病毒致弱突变株及其制备方法和应用。本发明专利技术中的致弱突变株是穿山甲冠状病毒GX/P2V连续传代8次的分离株，命名为GX_P2V分离株，基因序列GenBank登录号MW532698，所述分离株保藏在中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为：CGMCC No.23082。实验证明本发明专利技术中的分离株是一种新型突变株，通过体外细胞实验和体内动物实验证实了该突变株是高度减毒的，可在普通生物安全二级实验室常规培养，并可替代操作危险的SARS

【技术实现步骤摘要】
一种冠状病毒致弱突变株及其制备方法和应用


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一种冠状病毒致弱突变株及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]新型冠状病毒(SARS
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CoV
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2)属于β属冠状病毒，有包膜，颗粒呈圆形或椭圆形，常为多形性，直径60
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140nm。系统进化分析表明，SARS
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CoV
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2是一种不同于SARS
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CoV和MERS
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CoV的新型冠状病毒。到目前为止，中华菊头蝠体内的冠状病毒RaTG13与SARS
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CoV
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2全基因组序列同源性最高，为96.2％。除剌突基因外，小菊头蝠病毒RpYN06在大部分基因组中与SARS
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CoV
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2的亲缘关系最近。此外，在广东省和广西省查获的境外走私穿山甲样品中也发现了多种冠状病毒，已鉴定出的2种穿山甲冠状病毒GD/2019和GX/2017与SARS
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CoV
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2基因组序列具有高度的同源性(85.5％
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92.4％)【1、2】。特别是GD/2019的受体结合域(RBD)与SARS
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CoV
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2的RBD氨基酸序列相似性高达97.4％，GX/2017RBD与SARS
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CoV
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2RBD的氨基酸序列同源性为86.8％。研究表明，GX/2017棘突蛋白与人类ACE2结合并入侵宿主细胞的能力与SARS
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CoV
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2棘突蛋白相当【3】。此外，专利技术人团队前期对穿山甲冠状病毒GX/P2V近乎完整的基因组序列进行了分析(GenBank登录号MT072864)，结果显示穿山甲冠状病毒GX/P2V基因组有29,795个核苷酸，其中包括10个不确定的核苷酸和2个未知的末端。GX/P2V与穿山甲GX/2017其他5个分离株的基因组序列均具有很高的相似性(99.83～99.92％)，与SARS
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CoV
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2的棘突蛋白同源性达92.5％，是迄今为止成功分离到的与SARS
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CoV
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2棘突蛋白同源性最高的病毒【1】。该GX/P2V序列是从第一次传代的样品(穿山甲小肠
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肺混合样)中获得的，而不是连续传代的分离株。
[0003]SARS
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CoV
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2的传染性强，传播范围广，严重危害了全球的公共卫生安全，亟待有效的防控措施。因此，研发特异性治疗药物及安全有效的疫苗成为全球应急科研攻关的重要任务，然而，鉴于SARS
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CoV
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2活病毒操作的危险性，只能在生物安全三级(BSL
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3)及以上的实验室培养，极大的限制了相关研究的开展。因此，分离出类似SARS
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CoV
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2的冠状病毒致弱株且可在BSL
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2实验室常规培养的毒株，不仅能降低实验室成本和实验室要求，同时也为快速、安全地进行药物筛选、疫苗研发以及SARS
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CoV
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2感染分子机制等相关研究提供有力的工具。

技术实现思路

[0004]为克服现有技术中的问题，本专利技术提供了一种冠状病毒致弱突变株以及一种冠状病毒的减毒方法，通过对GX/P2V进行了8次连续传代培养，考虑到RNA病毒的多变性，进行了全基因组序列分析(GenBank登录号MW532698)，并命名为GX_P2V分离株。所述冠状病毒致弱突变株在体外和体内感染模型中都具有高度的减毒作用，可用于筛选对抗冠状病毒(尤其是新型冠状病毒)的药物以及疫苗的研发。
[0005]本专利技术提供了一种冠状病毒致弱突变株，所述冠状病毒致弱突变株是发生了冠状
病毒3'末端非翻译区(3'
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UTR)高变区(HVR)的核苷酸缺失。
[0006]在本专利技术的一个实施方案中，所述冠状病毒致弱突变株与穿山甲冠状病毒GX/P2V的基因序列(GenBank登录号MT072864)相比，该突变株的3'末端非翻译区(3'
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UTR)的高变区(HVR)缺失了104个核苷酸，缺失范围位于MT072864的第29,617至29,720位核苷酸。
[0007]在本专利技术的一个实施方案中，所述冠状病毒致弱突变株还包含单核苷酸突变，导致核蛋白的最后一位氨基酸Ala变为Val。
[0008]在本专利技术的一个实施方案中，所述冠状病毒致弱突变株GX_P2V分离株的全基因组核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:1所示。
[0009]在本专利技术的一个实施方案中，所述冠状病毒致弱突变株GX_P2V分离株于2021年7月23日保藏在中国普通微生物菌种保藏管理中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏编号为CGMCC No.23082。
[0010]本专利技术还提供了一种冠状病毒的减毒方法，其包括以下步骤：使冠状病毒基因组3'末端非翻译区(3'
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UTR)的高变区(HVR)核苷酸缺失，与GenBank登录号MT072864的穿山甲冠状病毒GX/P2V的基因组3'末端非翻译区(3'
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UTR)的高变区(HVR)相比，优选为104个核苷酸缺失。
[0011]在本专利技术的一个实施方案中，所述减毒方法还包括以下步骤：使核蛋白的最后一位氨基酸Ala置换为Val。
[0012]本专利技术还提供通过上述减毒方法获得的冠状病毒致弱突变株。
[0013]本专利技术还提供上述冠状病毒致弱突变株或者通过上述减毒方法获得的冠状病毒致弱突变株的应用，其用于抗冠状病毒(包括但不限于SARS
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CoV
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2病毒)活性药物的筛选与评价，抗冠状病毒(包括但不限于SARS
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CoV
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2病毒)疫苗的筛选与评价，以及用于抗冠状病毒(包括但不限于SARS
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CoV
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2病毒)减毒疫苗或灭活疫苗的制备，以及用于冠状病毒(包括但不限于SARS
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CoV
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2病毒)诊断和治疗性抗体的制备。其中所述疫苗中还包括药学上可接受的佐剂。
[0014]本专利技术还提供一种用于筛选和/或评价抗冠状病毒活性药物的药物筛选模型，其包括上述冠状病毒致弱突变株或通过上述减毒方法获得的冠状病毒致弱突变株。
[0015]根据本专利技术的药物筛选模型，其中采用所述穿山甲冠状病毒GX_P2V分离株感染的哺乳动物细胞，优选Vero细胞(非洲绿猴肾细胞)。
[0016]根据本专利技术的药物筛选模型，其中采用所述穿山甲冠状病毒GX_P2V分离株感染的哺乳动物，优选叙利亚金黄仓鼠。...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种冠状病毒致弱突变株，其特征在于，所述冠状病毒致弱突变株是发生了冠状病毒3'末端非翻译区(3'
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UTR)高变区(HVR)的核苷酸缺失。2.根据权利要求1所述的突变株，其特征在于，与GenBank登录号MT072864的穿山甲冠状病毒GX/P2V的基因序列相比，所述冠状病毒致弱突变株的3'末端非翻译区(3'
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UTR)的高变区(HVR)缺失了104个核苷酸，缺失范围位于MT072864的第29,617至29,720位核苷酸。3.根据权利要求2所述的突变株，其特征在于，与GenBank登录号MT072864的穿山甲冠状病毒GX/P2V的基因序列相比，所述冠状病毒致弱突变株还包含单核苷酸突变，导致核蛋白的最后一位氨基酸Ala变为Val。4.根据权利要求3所述的突变株，其特征在于，所述冠状病毒致弱突变株的全基因组核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。5.根据权利要求4所述的突变株，其特征在于，所述冠状病毒致弱突变株为GX_P2V分离株，于2021年7月23日保藏在中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No.23082。6.一种冠状病毒的减毒方法，其特征在于，包括以下步骤：使冠状病毒基因组3'末端非翻译区(3'
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UTR)的高变区(HVR)核苷酸缺失；优选地，与GenBank登录号MT072864的穿山甲冠状病毒GX/P2V的基因组3'末端非翻译区(3'
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UTR)的高变区(HVR)相比，有104个核苷酸缺失。7.根据权利要求6所述的冠状病毒的减毒方法，其特征在于，还包括以下步骤：使核蛋白最后一位氨基酸Ala置换为Val。8.权利要求1
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5任一项所述的冠状病毒致弱突变株或者...

【专利技术属性】
技术研发人员：童贻刚，卢姗姗，宋立华，范华昊，安小平，罗声栋，陈泽良，刘畅，
申请(专利权)人：北京化工大学，
类型：发明
国别省市：