产生活减毒疫苗的快速方法技术

本发明专利技术涉及一种产生活减毒疫苗的方法。在一些实施方案中，所述方法包括：a)修饰原始病毒以产生至少一种遗传上不同的不适应病毒；b)用所述至少一种不适应病毒感染宿主细胞；c)选择响应于使用所述至少一种不适应病毒进行的所述感染而显示出预选表型的宿主细胞并且从所述宿主细胞中分离所述不适应病毒的病毒核酸；d)对所述不适应病毒的分离的病毒核酸进行测序并且将其与所述原始病毒的核酸序列进行比较；e)从所述原始病毒重建所述不适应病毒以产生候选活减毒疫苗；以及f)针对预定表型筛选所述候选活减毒疫苗。本发明专利技术还涉及一种活减毒疫苗，所述活减毒疫苗是根据本发明专利技术的方法产生的。的。的。

【技术实现步骤摘要】
产生活减毒疫苗的快速方法
[0001]申请是申请号为201780030354.2、申请日为2017年4月13日、专利技术名称为“产生活减毒疫苗的快速方法”的中国专利技术专利申请的分案申请。
[0002]对相关申请的交叉引用
[0003]本申请要求2016年4月14日提交的新加坡申请号10201602980W的优先权益，该新加坡申请的内容在此以引用的方式整体并入本文用于所有目的。


[0004]本专利技术涉及一种产生活减毒疫苗，特别是活减毒病毒疫苗的方法。

技术介绍

[0005]活减毒疫苗(LAV)是含有活的但是具有降低的毒力的病原体包括病毒的疫苗，。LAV通常比灭活疫苗更有效，并且已经成功预防许多病毒性疾病，包括天花、水痘、麻疹、流行性腮腺炎、风疹以及黄热病。
[0006]常规上，LAV开发主要依赖于在细胞系或动物中连续传代时偶然发现病原体的减毒株。最近，已经使用靶向定点诱变来开发病原体的“减毒”株，尽管这些候选者尚有待于转化成用于人类的疫苗。因此，鉴定病原体的适当减毒株以进一步开发成疫苗仍是一个漫长的过程，通常涉及数年，而结果可能成功也可能失败。除了不可靠的结果之外，当前的疫苗开发方法还涉及显著的成本。
[0007]因此，需要提供一种快速和可靠的方法来产生克服或至少改善上述缺点的LAV。

技术实现思路

[0008]在一个方面，提供了一种产生活减毒疫苗(LAV)的方法，所述方法包括以下步骤：
[0009]a)修饰原始病毒以产生至少一种遗传上不同的不适应病毒；
[0010]b)用所述至少一种不适应病毒感染宿主细胞；
[0011]c)选择响应于由所述至少一种不适应病毒的感染而显示出预选表型的宿主细胞并且从所述宿主细胞中分离所述不适应病毒的病毒核酸；
[0012]d)对所述不适应病毒的分离的病毒核酸进行测序并且将其与所述原始病毒的核酸序列进行比较；
[0013]e)从所述原始病毒重建所述不适应病毒以产生候选活减毒疫苗；以及
[0014]f)针对预定表型筛选所述候选活减毒疫苗。
[0015]在另一个方面，提供了一种活减毒疫苗，其是根据如本文所述的方法产生的。
[0016]定义
[0017]本文所用的以下词语和术语应当具有所示的含义：
[0018]“疫苗”指的是提供对特定疾病的获得性免疫的生物制剂。疫苗包含刺激免疫应答以产生获得性免疫的药剂。疫苗中的药剂可以包括但不限于灭活病原体、减毒病原体、灭活毒素(类毒素)、蛋白质亚基或抗原和载体的缀合物中的一种或多种。
[0019]“活减毒疫苗”或“LAV”指的是包含活的但是具有降低的毒力的减毒病毒的疫苗。
[0020]关于原始病毒的术语“修饰(modifying)”和“修饰(modification)”指的是从原始病毒产生一种或多种遗传上不同的不适应病毒。不适应病毒是对预期宿主不适应以防止病毒适应宿主的先天免疫的病毒。修饰还允许产生遗传多样性病毒的群体以用于选择多种多样性病毒用于下游应用。不适应病毒可以通过将遗传变化引入到病毒的基因组中的任何手段来产生。
[0021]“宿主细胞”指的是将将被或被目标病毒感染的细胞。类似地，“宿主生物体”指的是将被或被目标病毒感染的生物体。
[0022]“诱导型报告基因”指的是表达处在启动子元件的控制之下的报告基因。例如转录因子对启动子元件的激活会诱导报告基因的表达。然后可以通过合适的检测手段来检测报告基因的表达。
[0023]“先天免疫”一般被本领域技术人员理解为指的是在暴露于抗原之后立即或不久激活的非特异性防御机制。涉及先天免疫应答的机制可以包括物理屏障，如上皮表面；炎症响应的激活、吞噬作用、补体激活、Toll样受体的激活、以及细胞因子，如干扰素的分泌。
[0024]“定点诱变”指的是在核酸序列内的一个或多个预定位置处引入一个或多个特定突变。
[0025]“重建病毒”指的是已经通过改变原始病毒的基因组以复制不适应病毒的基因组而产生的病毒。特别是，原始病毒的序列被改变以符合不适应病毒的序列。
[0026]原始病毒的基因组的改变可以通过从病毒产生的一个或多个感染性克隆的诱变，如定点诱变和/或通过切除或插入核酸的区段来实现。“重建病毒”还可以指的是已经在不存在细胞的情况下化学合成的病毒基因组。病毒基因组的化学合成可以包括化学合成核酸的短片段以及将所述片段组装在一起以形成合成病毒基因组。重建病毒也可以在宿主细胞中复制以按比例扩大重建病毒的产生用于下游应用。
[0027]“感染性克隆”指的是包含病毒遗传物质的质粒，所述病毒遗传物质已经被引入所述质粒中。感染性克隆可以使用本领域技术人员公知的常规方法产生。
[0028]“可操作地连接”或“操作性地连接”指的是物理上或功能上相互作用的两个或更多个核苷酸序列之间的关系。举例来说，启动子或调节核苷酸序列被说成是与编码RNA或蛋白质的核苷酸序列可操作地连接，前提条件是这两个序列被如此坐落，以使得所述调节核苷酸序列将影响所述编码或结构核苷酸序列的表达水平。一个基因的5'部分与一个基因的3'部分操作性地或可操作地连接，前提条件是这两个部分被坐落以形成功能基因。
[0029]“核酸”意指任何单链或双链RNA或DNA分子，如mRNA、cDNA、基因组DNA以及异源DNA。
[0030]一般将了解的是，术语病毒的“生长速率”指的是病毒在宿主细胞或宿主生物体内的复制速率。一般还将了解的是，宿主细胞或宿主生物体可以被病毒感染一段预定的时间。病毒的生长速率或复制速率可以通过以预定的时间间隔测量被特定病毒核酸或蛋白质感染的宿主细胞的百分比来确定。
[0031]“病毒”一般地指在其它生物体的细胞内复制的感染因子。病毒可以基于它们的核酸(RNA或DNA)、所述核酸是单链的还是双链的、是否利用逆转录酶、以及它们的核酸是单链RNA、它是正义的(+)还是反义的(
‑
)来分类。
[0032]“血清型”意指病毒抗原的免疫学上可区分的变体以使得免疫系统可以区分一种血清型与不同的血清型。举例来说，登革热病毒血清1型与登革热病毒血清2型是免疫学上可区分的。
[0033]“病毒株”指的是病毒种或血清型的遗传变体或亚型。一般应当了解的是，毒株可以具有相似的或不同的表型，包括但不限于毒力、生长速率以及感染性。
[0034]“登革热病毒”指的是属于黄病毒科(Flaviviridae)的黄病毒属(Flavivirus)的小包膜正链RNA病毒。存在四种登革热病毒血清型：登革热
‑
1(DENV
‑
1或D1)、登革热
‑
2(DENV
‑
2或D2)、登革热
‑
3(DENV
‑
3或D3)、以及登革热
‑
4(DENV
‑
4或D4)。这些亚型中的每一种在黄病毒科内形成抗原性不同的子组。
[0035]“本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种产生活减毒疫苗(LAV)的方法，所述方法包括以下步骤：a)修饰原始病毒以产生至少一种遗传上不同的不适应病毒；b)用所述至少一种不适应病毒感染宿主细胞；c)选择响应于使用所述至少一种不适应病毒进行的所述感染而显示出预选表型的宿主细胞并且从所述宿主细胞中分离所述不适应病毒的病毒核酸；d)对所述不适应病毒的分离的病毒核酸进行测序并且将其与所述原始病毒的核酸序列进行比较；e)从所述原始病毒重建所述不适应病毒以产生候选活减毒疫苗；以及f)针对预定表型筛选所述候选活减毒疫苗。2.如权利要求1所述的方法，其中在步骤a)中病毒的所述修饰是通过将所述病毒在属于不同于所述LAV的预期接受者的物种的细胞中传代至少一次、或通过暴露于化合物、或通过在低于37℃的温度下培养、或通过随机诱变、或其组合来实现。3.如权利要求2所述的方法，其中所述化合物是利巴韦林或5
‑
氟尿嘧啶(5
‑
FU)。4.如权利要求2所述的方法，其中所述随机诱变是易错聚合酶链反应(PCR)。5.如权利要求1所述的方法，其中在步骤a)中待修饰的所述原始病毒衍生自临床分离物。6.如权利要求1所述的方法，其中步骤b)的所述宿主细胞是人源性细胞。7.如权利要求6所述的方法，其中所述宿主细胞是HuH
‑
7或HEK293T。8.如权利要求6或7所述的方法，其中所述宿主细胞包含诱导型报告基因，所述诱导型报告基因可操作地连接至与先天免疫相关的至少一个启动子。9.如权利要求8所述的方法，其中所述诱导型报告基因包含与绿色荧光蛋白(GFP)基因可操作地连接的ISRE。10.如权利要求9所述的方法，其中所述ISRE与IRF3介导的应答有关。11.如权利要求1所述的方法，其中在步骤c)中的所述预选表型是空斑测定中的空斑尺寸或报告基...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄英勇，吴俊明，郭瑞升，邓俊杰，
申请(专利权)人：新加坡国立大学，
类型：发明
国别省市：