本发明专利技术属于减毒活疫苗制备技术领域，具体涉及小分子依赖的内含肽自剪接系统在制备减毒活疫苗中的应用。本发明专利技术所述小分子依赖的内含肽自剪接系统在制备减毒活疫苗中的应用，是将小分子依赖的内含肽自剪接系统插入病毒序列中制备得到减毒活疫苗，通过小分子调控内含肽进行自剪接，以控制病毒复制。首次将小分子调控的内含肽剪接系统应用于减毒活疫苗制备，本发明专利技术具有体系简单、效率高等优点，并且可以在体内控制病毒复制，最大程度的获得免疫效果。果。
【技术实现步骤摘要】
小分子依赖的内含肽自剪接系统在制备减毒活疫苗中的应用
[0001]本专利技术属于减毒活疫苗制备
，具体涉及小分子依赖的内含肽自剪接系统在制备减毒活疫苗中的应用。
技术介绍
[0002]致病病毒的防治是全球迫切的公共卫生问题之一，接种疫苗被证明是预防病毒性疾病最高效、最有力的方法。然而，新冠病毒和流感病毒的市售疫苗的免疫保护效力有限(Sandor A M，Sturdivant M S，Ting J.Influenza Virus and SARS
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CoV
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2Vaccines[J].J Immunol，2021，206(11)：2509
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2520.)。最大程度的保留病毒所有抗原，快速构建高变异减毒活疫苗的通用方法，一直是疫苗工作者追求的目标。
[0003]目前大多数疫苗依赖于灭活或减毒技术，这些方法已被成功地用于处理许多重要的动物和人类疾病，但这两种技术都存在其局限性和相关的潜在问题。灭活疫苗通常是无害和无传染性的，但产生的免疫反应维持时间较短，需要多次注射来增强它们整体免疫原性或功效。减毒活疫苗保留了活病毒的大部分基因序列，具有免疫力强、作用时间长等优点，但仍具有潜在致病危险。减毒活疫苗的产生有多种策略，包括NS1截短病毒(Pica N，Langlois R A，Krammer F，et al.NS1
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truncated live attenuated virus vaccine provides robust protection to aged mice from viral challenge[J].JVirol，2012，86(19)：10293
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10301.)、microRNA减毒病毒(Li J，Arevalo M T，Diaz
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Arevalo D，et al.Generation of a safe and effective live viral vaccine by virus self
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attenuation using species
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specific artificial microRNA[J].J Control Release，2015，207：70
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76.)、密码子去优化病毒(Jack B R，Boutz D R，Paff M L，et al.Reduced Protein Expression in a Virus Attenuated by Codon Deoptimization[J].G3(Bethesda)，2017，7(9)：2957
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2968.)、携带提前终止密码子(PTC)的病毒(Si L，Xu H，Zhou X，et al.Generation of influenza A viruses as live but replication
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incompetent virus vaccines[J].Science，2016，354(6316)：1170
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1173.)、高干扰素敏感病毒(Du Y，Xin L，Shi Y，et al.Genome
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wide identification of interferon
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sensitive mutations enables influenza vaccine design[J].Science，2018，359(6373)：290
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296.)、蛋白降解靶向嵌合病毒(PROTAC)(Si L，Shen Q，Li J，et al.Generation of a live attenuated influenza A vaccine by proteolysis targeting[J].Nat Biotechnol，2022.)等。目前的减毒策略往往伴随着安全性、有效性或生产力的降低或丧失。此外，季节性流行性流感持续的抗原漂移和转移导致的免疫逃逸给常规流感疫苗的效力带来了巨大的挑战。因此，提升减毒活疫苗的安全性和有效性是当前疫苗研发的重要方向。
[0004]内含肽(Intein)是一类非常有吸引力的分子开关，是位于宿主蛋白质中的一段插入序列，其对应的核苷酸序列嵌合在宿主蛋白对应的核酸序列之中，与宿主蛋白基因存在与同一阅读框架内，并与宿主蛋白质基因进行同步的转录和翻译，当翻译形成蛋白质前体
后，内含肽从蛋白质前体中切除，从而形成成熟的宿主蛋白。天然的内含肽不能够被小分子触发自剪切。哈佛大学David R.Liu教授进化了一种基于内含肽的分子开关，这个分子开关可将小分子的结合转化成目标蛋白质的激活(Buskirk A R，Ong Y C，Gartner Z J，et al.Directed evolution of ligand dependence：small
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molecule
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activated protein splicing[J].Proc Natl Acad Sci U S A，2004，101(29)：10505
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10510.)。人的雌激素受体配体结合区域(ER
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LBD，残基304
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551)与高亲和力的合成小分子4
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HT结合后，第12螺旋发生大幅的构象转变，从而拉近ER
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LBD的N和C末端的之间的距离。他们将RecA内含肽结构中的非必需归巢核酸内切酶区域替换为ER
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LBD，得到424个残基的N端剪接区
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ER
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LBD
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C剪接区域内含肽融合蛋白。将ER
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LBD天然配体结合域插入到RecA内含肽中可破坏其自剪接活性。为了以配体依赖的方式恢复活性，他们将蛋白质剪接与酿酒酵母的细胞存活或荧光联系起来，通过反复的诱变和选择，产生了高度依赖4
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HT的具有强剪接活性的内含肽。并经多轮蛋白定向进化筛选，得到一套低背景、快速剪切、适用哺乳细胞的内含肽Intein系统：37R3
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2(Peck SH，Chen I，Liu DR.Directed evolution of a small
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molecule
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triggered intein with improved splicing properties in mammalian cells[J].Chem.Biol，2011,18(5):619
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630.)。他们之所以选择结核分枝杆菌RecA的内含子，是因为它可以在各种环境中有效地剪接。最近，他们将进化的37R3
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2插入到Cas9的特定位置，开发了一种4
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HT触发的Cas9核酸酶(Davi本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.小分子依赖的内含肽自剪接系统在制备减毒活疫苗中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：将小分子依赖的内含肽自剪接系统插入病毒基因序列中制备得到减毒活疫苗，通过小分子调控内含肽进行自剪接，以控制病毒复制。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：减毒活疫苗包括流感病毒、新冠病毒、艾滋病毒、埃博拉病毒、登革热病毒、脊髓灰质炎病毒、乙型脑炎病毒、寨卡病毒、水痘—带状疱疹病毒、单纯疱疹病毒和人巨细胞病毒的减毒活疫苗。4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：内含肽自剪接系统为37R3
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2，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：小分子为4
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羟基他莫昔芬，其结构式如式(Ⅰ)所示：6.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：插入位点位于与病毒免疫原性无关的结构蛋白序列。7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：...
【专利技术属性】
技术研发人员：董铭心，陈积，
申请(专利权)人：青岛大学，
类型：发明
国别省市：
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