抗鼠抗体可结晶段的纳米抗体及其应用制造技术

本发明专利技术公开了两个抗鼠抗体可结晶段的纳米抗体，以及它们的表达、纯化和鉴定。抗鼠抗体可结晶段的纳米抗体在生物医药中有广泛的应用，不仅可以用于鼠抗体蛋白的纯化，还可以用于免疫检测、临床诊断和药物治疗。临床诊断和药物治疗。临床诊断和药物治疗。

【技术实现步骤摘要】
抗鼠抗体可结晶段的纳米抗体及其应用


[0001]本专利技术涉及抗体技术和生物医药领域，特别是将纳米抗体应用于蛋白纯化，应用于检测、诊断和治疗。

技术介绍

[0002]抗体（Antibody）是一类能与抗原特异性结合的免疫球蛋白，在血液中含量丰富。抗体存在多种亚型，如IgA、IgG、IgM、IgD、IgE，它们在生物特性、功能区域以及结合不同抗原的能力方面均有所不同，最广泛存在的亚型是 IgG。结构上，大多数抗体都是由较长的重链和较短的轻链组合而成的多聚体，多聚体上根据功能，分为了与抗原结合的Fab段和不与抗原结合的Fc段，Fc段又称为“可结晶”段（crystallizable fragment）。
[0003]抗体在生物医药领域有广泛的应用。在蛋白的分离纯化方面，抗体可以接上层析介质，做成分离抗原蛋白的亲和层析柱、亲和磁珠等，用来分离抗原蛋白，例如用抗人血清白蛋白的抗体做成亲和层析柱来制备高纯度的人血清白蛋白产品。在检测方面，食品安全监管需要及时检测农药残留、非法添加物等，各种基于免疫层析原理的快速检测条由于简单、方便、快速、价廉，在食品监管上应用很普遍。在临床诊断方面，免疫检测是重要的检测技术，具体的实例是目前广泛应用的新冠抗原检测，利用针对新冠病毒的核蛋白（N protein）的两个抗体，采用双抗夹心法，制备成快速检测条，定性或定量地检测新冠病毒的存在。在治疗药物方面，抗体已经成为重要的药物种类，不仅抗体本身可以作为药物，而且抗体药物还包括了由抗体衍生的抗体
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毒素蛋白偶联体（immunotoxin）、抗体
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药物偶联体（antibody
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drug conjugate, ADC）、双抗和多抗（bispecific antibody, multi
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specific antibody），等。
[0004]抗体分为多克隆抗体和单克隆抗体。多克隆抗体由免疫动物产生，为抗体的混合物，各批次间的抗体组成不同，效价有差异。单克隆抗体由单一基因产生，克服了多克隆抗体的批间次差异的问题。但单克隆抗体存在以下特点和不足：研发周期长，生产周期长，制备成本高，在机体内不易被清除，穿透能力弱。
[0005]纳米抗体是常规抗体的简化形式，早期在羊驼等动物的抗体中发现一种只有重链的抗体，通过仅保留与抗原结合的单个结构域，构建成为大小在纳米级别的纳米抗体，又称为单域抗体。纳米抗体保留了常规抗体对抗原的高亲和性和高特异性，还有以下优点：单个结构域的稳定性高；能够在原核或真核细胞中高效表达；在原核细胞表达时，生长周期短、制备成本低；对人的免疫原性弱；分子量小，穿透能力强，甚至可以穿透血脑屏障。纳米抗体在生物医药中得到了越来越广泛的应用，如获批上市的双特异性纳米抗体Ozoralizumab，利用抗人血清白蛋白的纳米抗体对白蛋白的高亲和性，来延长在体内的存留时间，同时利用另一个融合在一起的抗肿瘤坏死因子TNFα的纳米抗体，靶向药物作用分子，用于治疗类风湿性关节炎。
[0006]蛋白分离纯化，包括抗体蛋白的分离纯化，有巨大的需求。虽然原理上抗体可以用于制备分离纯化抗原蛋白的亲和层析柱，但由于常规抗体的稳定性差、生产成本高，用抗体
13所示，编码纳米抗体MY50与谷胱甘肽转移酶构成的融合蛋白的完整核酸序列如SEQ ID NO: 14所示。
[0012]更进一步，通过对纳米抗体或纳米抗体构建的融合蛋白加以修饰，可以赋予修饰后的纳米抗体融合蛋白更多的特性和功能。修饰的方式可以是物理吸附，例如用胶体金、胶体银、胶体碳等来标记，用于显色，便于肉眼观察。修饰的方式也可以是共价键结合的化学修饰，例如在实施例中描述的，本专利技术公布的纳米抗体在鉴定过程中，对其进行生物素化，使其能够与亲和素或链霉亲和素结合、更便于定量。
[0013]本专利技术公布的两个纳米抗体结构明确，抗体蛋白表面的可修饰基团的定位也很明确，可以对本专利技术的纳米抗体或纳米抗体构建的融合蛋白进行化学修饰，常用的修饰位点是修饰在赖氨酸残基上的氨基、谷氨酸和天冬氨酸的羧基、等。为了使修饰更方便、使修饰定位和定量更加准确，也可以在纳米抗体的N端、C端或其他特定部位引入特定的可修饰化学基团，然后对其进行化学修饰，如引入半胱氨酸得到特定可修饰位点的巯基。与氨基、羧基、巯基的蛋白修饰反应多种多样，技术成熟。如与异硫氰酸荧光素（FITC）反应，或活化的生物素反应，发生在纳米抗体的氨基上，得到具有荧光的、或生物素化的纳米抗体。可以对本专利技术的纳米抗体进行化学修饰的材料多种多样，包括亲和层析填料、量子点、磁珠、彩色微球或荧光微球、蛋白（如辣根过氧化物酶）、化学小分子等。对所述的化学修饰的材料的要求是具有可以用于化学修饰的活性基团或可活化基团，如羧基、氨基、巯基、等。
[0014]对本专利技术公布的纳米抗体，以融合蛋白和化学修饰的方式，在这些纳米抗体对抗原特异识别的基础上，赋予了诸如颜色、荧光、磁性、生物活性、等外加功能，使其在蛋白分离和浓缩、抗原的检测等方面，在开发各种检测试剂、临床诊断试剂和治疗药物等方面，有广泛的应用前景。在蛋白分离纯化上，抗鼠抗体可结晶段的纳米抗体可以通过化学修饰基团接上磁珠，构建亲和磁珠，利用纳米抗体对做为抗原的鼠抗体蛋白的特异性结合能力，利用磁分离技术，使用磁场从悬浮液中直接将鼠抗体蛋白用沉淀的方式分离出来；同样，纳米抗体可以通过化学修饰基团接上层析填料（如葡聚糖、琼脂糖、等），构建亲和层析填料，用亲和层析方法，分离纯化鼠抗体蛋白。在检测、诊断和治疗上，具体的产品多种多样。例如，用于食品安全检测用的和临床诊断用的快速检测卡（如新冠抗原检测快检条），可以用胶体金或荧光微球标记抗鼠抗体可结晶段的纳米抗体或纳米抗体衍生物，与检测线或质控线上的鼠源抗体结合显色，用于小分子抗原或大分子抗原的定性、定量检测。又例如，检测和诊断常用的酶联免疫ELISA方法，可以用纳米抗体取代常规抗体，采用抗原抗体竞争法或双抗夹心法，用本专利技术公开的抗鼠抗体可结晶段的纳米抗体与鼠源的抗体的特异性结合，作为一抗或二抗，定性或定量测定抗原的含量。
附图说明
[0015]图1为纳米抗体MX21对不同种属（鼠、兔、羊）的抗体抗原的亲和性分析结果。
[0016]图2为纳米抗体MY50对不同种属（鼠、兔、羊）的抗体抗原的亲和性分析结果。
[0017]图3为生物素标记的纳米抗体MX21，在非标记的MX21或MY50存在与否时，对鼠抗体抗原的亲和性分析结果。
[0018]图4为纳米抗体MX21和MY50的氨基酸全长序列和CDR区域。CDR1，CDR2和CDR3区域分别用下划线标注。
具体实施方式
[0019]在本专利技术的研究中，纳米抗体文库的库容量和多样性是淘选出高特异性、高亲和力纳米抗体的关键。本专利技术使用的合成文库的最终库容量达到8
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10
9 pfu，保证了文库的多样性。抗原采用的是大肠杆菌表达的鼠抗体可结晶段重组蛋白。本专利技术采用固相淘选的方式，淘选过程中，聚苯乙烯塑料平板本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.抗鼠抗体可结晶段的纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别由SEQ ID NO: 1
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3或SEQ ID NO: 4
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6所示。2.抗鼠抗体可结晶段的纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体的氨基酸序列分别由SEQ ID NO: 7或8所示。3.纳米抗体与多肽或蛋白融合构建的纳米抗体融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白含有：（a）权利要求1或2所述的纳米抗体；和（b）选自下组的多肽和蛋白的融合部分：蛋白标签、碱性磷酸酶、麦芽糖结合蛋白、谷胱甘肽转移酶、和毒素蛋白。4.权利要求3所述的纳米抗体融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白的融合部分为：（a）组氨酸蛋白标签，（b）麦芽糖结合蛋白，或（c）谷胱甘肽转移酶。5.编码纳米抗体融合蛋白的核酸序列，其特征在于，（a）含有权利要求4所述的纳米抗体融合蛋白，（b）缺失信号肽，导致融合蛋白表达在细胞浆内，和（c）...

【专利技术属性】
技术研发人员：叶其壮，赖文珊，杨小乐，郭媛媛，肖利群，
申请(专利权)人：广州明药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：