【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及抗体技术和生物医药领域，特别是将纳米抗体应用于蛋白纯化，应用于检测、诊断和治疗。
技术介绍
1、人转铁蛋白（transferrin，trf）是血浆中存在的转运铁的蛋白，负责转运由消化道吸收的铁和由红细胞降解释放的铁。转铁蛋白可逆性地结合铁和其他金属离子如铜、锌、钴等。转铁蛋白主要由肝脏合成，受铁供应调节，半衰期为7天。在人血液中含量丰富，正常成人的参考值为2.2-4.0 g/l。人转铁蛋白是单链糖蛋白，含糖量约6%。由678个氨基酸构成，分子量为76 kda。
2、抗体对抗原具有特异性结合的能力，能够识别不同的蛋白和非蛋白抗原，在生物医药领域有广泛的应用，市场上有针对人转铁蛋白的抗体。在蛋白的分离纯化方面，抗体可以与层析介质偶联，做成分离目标蛋白的亲和层析柱，例如用抗转铁蛋白的抗体可以做成亲和层析柱来制备高纯度的转铁蛋白产品。在检测方面，食品安全监管需要及时检测农药残留和非法添加物。各种基于免疫层析原理的快速检测试纸条，由于简单、方便、快速、价廉，在食品安全监管上发挥了巨大作用。在临床诊断方面，免疫检测是重要的检测技术，具体的实例是目前广泛应用的新冠抗原检测，利用针对新冠病毒的核蛋白（n protein）的两个抗体，采用双抗夹心法，制备成免疫层析快速检测试纸条，定性或定量地检测新冠病毒的存在或多少。在治疗药物方面，抗体已经成为重要的药物种类，不仅抗体本身可以作为药物，而且抗体药物还包括了由抗体衍生的免疫毒素（immunotoxin）、抗体-药物偶联物（antibody-drug conjugate, a
3、抗体分为多克隆抗体和单克隆抗体。多克隆抗体由免疫动物产生，是多种不同抗体的混合物，能识别不同的抗原表位。多克隆抗体各批次间的抗体组成不同，效价有差异。单克隆抗体由单一基因产生，克服了多克隆抗体的批间次差异的问题。但单克隆抗体存在以下特点和不足：研发周期长，生产周期长，制备成本高。
4、纳米抗体是常规抗体的简化形式，源于在羊驼等动物的抗体中发现的一种只有重链的抗体。通过仅保留与抗原结合的单个结构域，构建成为大小在纳米级别的纳米抗体，又称为单域抗体，由单一基因产生。纳米抗体保留了常规抗体对抗原的高亲和性和高特异性，还有以下优点：单个结构域的稳定性高；能够在原核或真核细胞中高效表达；在原核细胞表达时，生长周期短、制备成本低；对人的免疫原性弱；分子量小，穿透能力强，甚至可以穿透血脑屏障。纳米抗体在生物医药中得到了越来越广泛的应用，如获批上市的双特异性纳米抗体ozoralizumab，利用抗人血清白蛋白的纳米抗体对白蛋白的高亲和性，来延长在体内的存留时间，同时利用另一个融合在一起的抗肿瘤坏死因子tnfα的纳米抗体，靶向药物作用分子，用于治疗类风湿性关节炎。
5、蛋白分离纯化，包括抗体蛋白的分离纯化，有巨大的需求。虽然原理上抗体可以用于制备分离纯化抗原蛋白的亲和层析柱，但由于常规抗体的稳定性差、生产成本高，用抗体制备的亲和层析柱至今并没有得到广泛的应用。以抗体蛋白的纯化为例，普遍用的还是蛋白a制备的亲和层析柱。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供抗人转铁蛋白的纳米抗体，该纳米抗体对与人转铁蛋白的结合具有高亲和力和特异性，可以用于制备分离纯化人转铁蛋白的亲和层析产品，可以用于制备人转铁蛋白相关的检测和诊断试剂产品和治疗药物，具有良好的应用前景。
2、本专利技术的第一方面提供了两个抗人转铁蛋白的纳米抗体，tt7和tt30。纳米抗体的互补决定区（complementary determining region, cdr）是特异性识别抗原的关键结构。纳米抗体tt7的互补决定区分别由seq id no: 1对应其cdr1、seq id no: 2对应其cdr2、seq id no: 3对应其cdr3。同样的，纳米抗体tt30的互补决定区分别由seq id no: 4对应其cdr1、seq id no: 5对应其cdr2、seq id no: 6对应其cdr3。
3、本专利技术的第二方面提供了如本专利技术的第一方面所述的两个抗人转铁蛋白的纳米抗体tt7和tt30的完整氨基酸序列。纳米抗体的氨基酸序列由大约110-130个氨基酸残基组成，有四个骨架区（fm1-4）和三个互补决定区（cdr1-3），按顺序交错排列构成。除了互补决定区对抗原的识别起决定性作用外，骨架区对互补决定区的空间结构有影响、进而影响对抗原的识别。因此，纳米抗体tt7和tt30的完整氨基酸序列也是决定抗原识别的重要结构基础。tt7的完整氨基酸序列如seq id no: 7所示，tt30的完整氨基酸序列如seq id no: 8所示。
4、本专利技术公布的两个抗人转铁蛋白的纳米抗体分别含有120和115个氨基酸残基，形成该纳米抗体的核心结构。在实际应用中，纳米抗体常以融合蛋白的形式存在，即在纳米抗体的核心结构的n末端或c末端加上氨基酸残基、多肽和蛋白，形成融合蛋白，在保留原本纳米抗体的亲和性和特异性的同时，赋予融合蛋白更多的特性和功能。例如：在其n端加上甲硫氨酸来引入基因表达的起始编码（atg），或加上信号肽来将表达的蛋白导入周质空间（periplasmic space）；在其c末端与作为蛋白标签（如组氨酸标签、人流感血凝素标签）的多肽融合，使其能够用镍柱进行纯化、用抗人流感血凝素抗体进行鉴定；与荧光蛋白融合使得能够显色和显荧光用于示踪；与细胞毒蛋白融合成为免疫毒素（immunotoxins）用于治疗。
5、本专利技术的第三方面提供了由纳米抗体与多肽和蛋白融合所构建的纳米抗体融合蛋白。所述的纳米抗体为本专利技术的第一方面和第二专利技术所述的纳米抗体tt7和tt30。对纳米抗体在蛋白基因水平加以修饰、构建融合蛋白，是纳米抗体相对于常规抗体的明显优势，有成熟的分子生物学方法，也是常见的纳米抗体具体体现的形式。可以与纳米抗体融合的多肽和蛋白多种多样。
6、在一些优选的实例中，与纳米抗体融合的多肽和蛋白包括各种蛋白标签，如：组氨酸his标签（hhhhhh）、人流感病毒血凝素ha标签（ypydvpdya）、flag标签（dykddddk）、和myc标签（eqkliseedl）。
7、在另一些优选的实例中，与纳米抗体融合的多肽和蛋白包括各种荧光蛋白，如绿色荧光蛋白（gfp）、蓝色荧光蛋白（bfp）、和红色荧光蛋白（rfp）。
8、在另一些优选的实例中，与纳米抗体融合的多肽和蛋白包括有酶催化活性的蛋白，如碱性磷酸酶（ap）、辣根过氧化物酶（hrp）、和发光酶（luciferase）。
9、在另一些优选的实例中，与纳米抗体融合的多肽和蛋白包括有其他生物活性的蛋白，如麦芽糖结合蛋白（mbp）、谷胱甘肽转移酶（gst）、毒素蛋白、和抗体fc片段。
10、本专利技术的第四方面提供了如本专利技术的第三方面所述的纳米抗体融合蛋白的具体实本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.抗人转铁蛋白的纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体的氨基酸序列的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO: 1-3所示或SEQ ID NO: 4-6所示。
2.权利要求1所述的纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:7或SEQ ID NO: 8所示。
3.纳米抗体与多肽或蛋白融合构建的纳米抗体融合蛋白，其特征在于，所述纳米抗体融合蛋白含有：（a）权利要求1或2所述的纳米抗体；和（b）选自下组的多肽或蛋白的融合部分：组氨酸His标签、人流感血凝素HA标签、FLAG标签、Myc标签、绿色荧光蛋白、碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、发光酶、麦芽糖结合蛋白、谷胱甘肽转移酶、毒素蛋白、和抗体Fc片段。
4.权利要求3所述的纳米抗体融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白的融合部分为：（a）组氨酸蛋白标签，（b）麦芽糖结合蛋白，或（c）谷胱甘肽转移酶；编码所述的纳米抗体融合蛋白的核酸序列分别由SEQ ID NO: 9-14所示。
5.权利要求1或2所述的纳米抗体、或权利要求3或4所述的纳米抗体融合
6.免疫层析试纸条，其特征在于，（a）含有权利要求1或2所述的纳米抗体，权利要求3或4所述的纳米抗体融合蛋白，或权利要求5所述的的纳米抗体衍生物；和（b）由样本垫、层析垫、和吸收垫组成。
7.权利要求6所述的免疫层析试纸条在体外定性或定量检测生物体液中的转铁蛋白的用途，所述生物体液包括血液、组织液、唾液、泪液、尿液、和粪便。
8.权利要求1或2所述的纳米抗体、权利要求3或4所述的纳米抗体融合蛋白、或权利要求5所述的纳米抗体衍生物在制备转铁蛋白检测试剂产品的用途，所述检测试剂产品包括免疫层析试剂盒、酶联免疫吸附试剂盒、免疫比浊法试剂盒、和化学、电化学和生物发光试剂盒。
9.权利要求1或2所述的纳米抗体、权利要求3或4所述的纳米抗体融合蛋白、或权利要求5所述的纳米抗体衍生物在制备转铁蛋白亲和介质产品的用途，所述亲和介质产品包括修饰的聚合物微球、磁微球、琼脂糖、葡聚糖、纤维素、和过滤膜。
10.权利要求1或2所述的纳米抗体、权利要求3或4所述的纳米抗体融合蛋白、或权利要求5所述的纳米抗体衍生物在制备在生物体内识别转铁蛋白的靶向物的用途，所述靶向物中包括免疫毒素，抗体-药物偶联物、和双特异性或多特异性抗体。
...【技术特征摘要】
1.抗人转铁蛋白的纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体的氨基酸序列的互补决定区cdr1、cdr2、cdr3的氨基酸序列如seq id no: 1-3所示或seq id no: 4-6所示。
2.权利要求1所述的纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体的氨基酸序列如seq id no:7或seq id no: 8所示。
3.纳米抗体与多肽或蛋白融合构建的纳米抗体融合蛋白，其特征在于，所述纳米抗体融合蛋白含有：（a）权利要求1或2所述的纳米抗体；和（b）选自下组的多肽或蛋白的融合部分：组氨酸his标签、人流感血凝素ha标签、flag标签、myc标签、绿色荧光蛋白、碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、发光酶、麦芽糖结合蛋白、谷胱甘肽转移酶、毒素蛋白、和抗体fc片段。
4.权利要求3所述的纳米抗体融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白的融合部分为：（a）组氨酸蛋白标签，（b）麦芽糖结合蛋白，或（c）谷胱甘肽转移酶；编码所述的纳米抗体融合蛋白的核酸序列分别由seq id no: 9-14所示。
5.权利要求1或2所述的纳米抗体、或权利要求3或4所述的纳米抗体融合蛋白经修饰物修饰产生的纳米抗体衍生物，其特征在于：（a）是与修饰物非共价键结合形成的纳米抗体衍生物，所述修饰物包括胶体金、胶体银、或胶体碳；或（b）是与修饰物共价键结合形成的纳米抗体衍生物，所述修饰物包括彩色微球、荧光微球...
【专利技术属性】
技术研发人员：叶其壮，黄俊鹏，王梓杨，郭媛媛，肖利群，
申请(专利权)人：广州明药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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