靶向轮状病毒蛋白的纳米抗体及其应用制造技术

轮状病毒是一种能引起急性胃肠道疾病（腹泻）的病毒。本发明专利技术公开了一种靶向轮状病毒衣壳蛋白的纳米抗体，以及它的表达、纯化和鉴定。靶向轮状病毒的纳米抗体可以用于轮状病毒的环境监控和轮状病毒感染的临床诊断和治疗。环境监控和轮状病毒感染的临床诊断和治疗。环境监控和轮状病毒感染的临床诊断和治疗。

Nano antibody targeting rotavirus protein and its application

【技术实现步骤摘要】
靶向轮状病毒蛋白的纳米抗体及其应用


[0001]本专利技术涉及抗体技术和生物医药领域，特别是对轮状病毒传播的监控和对轮状病毒感染疾病的诊断与治疗。

技术介绍

[0002]轮状病毒（Rotavirus，RV）是一种双链核糖核酸病毒，由澳大利亚学者露丝
·
毕夏普在1973年首次利用电镜发现，因其形似车轮而得名。它是在全世界范围内诱发儿童严重腹泻的主要原因，另外它还可以引发人类或动物急性胃肠道疾病。但是截止到目前为止，市面上尚没有能够有效治疗轮状病毒感染的特效药，因此，研究一种快速并准确的轮状病毒早期检测方法，对于该病毒的防治具有深远的意义。
[0003]单克隆抗体主要以实验小鼠为宿主进行制备，其制备方法通常是：由轮状病毒感染动物细胞后，培养细胞得到的培养液中含有较多的轮状病毒，以其对实验小鼠进行免疫处理，处理结束后杀死免疫成功的小鼠，并在无菌条件下取其脾脏，将其与骨髓瘤细胞进行融合，通过ELISA等方法筛选出阳性克隆。筛选得到的细胞经过克隆化后形成稳定的细胞株，将此细胞株进行体外培养或小鼠体内诱生腹水形成，再从培养基或者腹水中纯化即可得到轮状病毒单抗，最后用蛋白质印迹法等方法进行鉴定即可。
[0004]目前通过上述手段进行制备的轮状病毒特异性抗体为传统单克隆抗体，传统单克隆抗体存在以下不足：研发周期长，生产周期长，制备成本高，较高的免疫原性，在机体内不易被清除，穿透能力弱。而从羊驼等动物衍生而来的纳米抗体保留了传统单克隆抗体的亲和性和特异性，还有以下优点：原核或真核细胞中表达量高，原核细胞生长周期短，制备成本低，对人的免疫原性弱，分子量小，穿透能力强，甚至可以穿透血脑屏障，特异性强，亲和力高。而关于抗轮状病毒纳米抗体的制备目前尚未见报道。
[0005]总的来说，纳米抗体在检测、诊断和药物领域的潜力巨大，通过筛选获得的靶向轮状病毒的纳米抗体将补充和取代传统单克隆抗体，在生物医药领域将有广泛的应用前景。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的在于提供一种靶向轮状病毒衣壳蛋白的纳米抗体，该纳米抗体对轮状病毒衣壳蛋白抗原有高亲和力，可用于轮状病毒的分离、检测和治疗，特别是检测试剂盒的研发，具有良好的应用前景。
[0007]一般来讲，纳米抗体的氨基酸顺序由大约100
‑
130个氨基酸残基组成，有四个骨架区（FM1
‑
4）和三个互补决定区（CDR1
‑
CDR3），按顺序交错排列构成。本专利技术公布了的靶向轮状病毒的纳米抗体Rot1有四个骨架区和三个互补决定区。纳米抗体Rot1的互补决定区分别由SEQ ID NO: 1对应其CDR1、SEQ ID NO: 2对应其CDR2、SEQ ID NO: 3对应其CDR3。
[0008]本专利技术公布的靶向轮状病毒蛋白的纳米抗体Rot1，除了三个互补决定区对抗原的识别起决定性作用外，四个骨架区对互补决定区的空间结构有影响、进而影响对抗原的识别。因而，纳米抗体Rot1的完整氨基酸顺序也是决定抗原识别的重要基础。Rot1的完整氨基
酸顺序如SEQ ID NO: 4所示。
[0009]本专利技术公布的靶向轮状病毒蛋白的纳米抗体含有124个氨基酸残基，形成该纳米抗体的核心结构。纳米抗体的核心结构本身，在不增加氨基酸残基的情况下，具有与所述抗原蛋白的高亲和性和高特异性。实际上，纳米抗体常以融合蛋白的形式存在，即在纳米抗体的核心结构的N末端或C末端加上多肽和蛋白，形成融合蛋白，在保留原本纳米抗体的高亲和性和高特异性的同时，赋予融合蛋白更多的特性和功能。例如在淘选和鉴定本专利技术公布的纳米抗体的过程中，在其C末端与作为蛋白标签（如组氨酸标签、人流感血凝素标签）的多肽融合，使其能够用镍柱进行纯化、用抗人流感血凝素抗体进行鉴定。纳米抗体Rot1与组氨酸标签和人流感血凝素标签构成融合蛋白，编码其完整氨基酸顺序的DNA序列如SEQ ID NO: 5所示。
[0010]对纳米抗体在蛋白基因水平加以修饰，是纳米抗体相对于常规抗体的明显优势，有成熟的分子生物学方法，融合蛋白也是常见的纳米抗体具体体现的形式。可以与纳米抗体融合的多肽和蛋白多种多样，包括各种蛋白标签（组氨酸标签His，人流感病毒血凝素标签HA，FLAG标签，MBP标签、Myc标签、等）、绿色荧光蛋白、碱性磷酸酶、发光酶、谷胱甘肽转移酶、毒素蛋白、抗体Fc片段、等。融合蛋白使具有靶向抗原功能的纳米抗体有了更多的功能，如与荧光蛋白融合显色和显荧光用于示踪、与细胞毒蛋白融合成为免疫毒素（immunotoxins）用于治疗等。
[0011]更进一步，通过对纳米抗体或纳米抗体构建的融合蛋白加以化学修饰，可以赋予修饰后的纳米抗体蛋白更多的特性和功能。例如在实施例中描述的，本专利技术公布的纳米抗体在鉴定过程中，对其进行生物素化，使其能够与亲和素或链霉亲和素结合、更便于定量。
[0012]本专利技术公布的靶向轮状病毒蛋白的纳米抗体有124个氨基酸残基，结构明确，抗体蛋白表面的可修饰基团的定位也很明确，可以对本专利技术的纳米抗体或纳米抗体构建的融合蛋白进行化学修饰，常用的修饰位点是修饰在赖氨酸残基上的氨基、谷氨酸和天冬氨酸的羧基、等。为了使修饰更方便、使修饰定位和定量更加准确，也可以在纳米抗体的N末端、C末端或其他特定部位引入特定的化学修饰基团，然后对其进行化学修饰，如引入半胱氨酸得到特定可修饰位点的巯基。与氨基、羧基、巯基的蛋白修饰反应多种多样，技术成熟。如与异硫氰酸荧光素（FITC）反应，或活化的生物素反应，发生在纳米抗体的氨基上，得到具有荧光的、或生物素化的纳米抗体。可以对本专利技术的纳米抗体进行化学修饰的材料多种多样，包括亲和层析填料、量子点、磁珠、彩色微球或荧光微球、蛋白（如辣根过氧化物酶）、化学小分子等。对所述的化学修饰的材料的要求是具有可以用于化学修饰的活性基团或可活化基团，如羧基、氨基、巯基、等。
[0013]具体的纳米抗体的应用场景很多。举例一是纳米抗体Rot1与磁珠结合，用于轮状病毒的浓缩和分离。市售的磁珠有很多在表面具有氨基或羧基等可修饰基团，纳米抗体表面也有可修饰基团，因而可以通过成熟的蛋白偶联方法（如重氮法、戊二醛法、戊二酸酐法、碳化二亚胺法、等），将纳米抗体与磁珠共价键连接。溶液中，纳米抗体识别并结合轮状病毒，纳米抗体与磁珠的偶联物可以用磁场将轮状病毒捕获、富集、分离。举例二是用纳米抗体Rot1构建定量免疫检测试剂盒。制备酶联免疫吸附测定法（ELISA）试剂盒时，用轮状病毒抗原蛋白包被酶标板，加入含有轮状病毒的待测溶液，再加入生物素化的纳米抗体蛋白。溶液中轮状病毒上的抗原将与包被在酶标板上的轮状病毒抗原，竞争性地与生物素化的纳米
9.0）进行中和，涡旋混匀，取20 μL保存作为测定滴度样本，剩下的样本全部进行扩增后用于下一轮淘选。
[0023]实施例二、阳性克隆的鉴定从测定滴度的平板上随机挑取单菌落进行噬菌体的拯救纯化，之后采用ELISA方法进行阳性克隆的鉴定。具体步骤为：在八连孔酶标条的孔中分别加入100 μL浓度为10 μg本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.靶向轮状病毒蛋白的纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体的氨基酸序列的互补决定区（CDR）包括如SEQ ID NO: 1所示的CDR1，如SEQ ID NO: 2所示的CDR2，和如SEQ ID NO: 3所示的CDR3。2.靶向轮状病毒蛋白的纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO: 4所示。3.权利要求1或2所述的纳米抗体，用于与多肽和蛋白...

【专利技术属性】
技术研发人员：叶其壮，白晓康，王梓杨，陈锦德，肖利群，
申请(专利权)人：广州明药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：