噬菌体展示新冠病毒衣壳蛋白及应用制造技术

本发明专利技术通过噬菌体展示技术，将动物病毒的衣壳蛋白通过融合蛋白的方式展示在细菌病毒（即噬菌体）表面，提供一种安全有效地研究动物病毒衣壳蛋白结构与功能的工具。具体实例是将新冠病毒的衣壳S蛋白的受体结合结构域与M13噬菌体衣壳P9蛋白融合，展示在M13噬菌体表面，并且显示了与其特异抗体的结合能力。本发明专利技术的有益效果是可以用无致病性的噬菌体替代有致病性的动物病毒（如当前的新冠病毒），用于检测试剂、诊断方法、疫苗、和治疗药物的研发。疫苗、和治疗药物的研发。疫苗、和治疗药物的研发。

【技术实现步骤摘要】
噬菌体展示新冠病毒衣壳蛋白及应用


[0001]本专利技术属于生物
，涉及用细菌病毒展示动物病毒表面抗原的方法，尤其是展示新冠病毒的RBD受体结合结构域。

技术介绍

[0002]新冠肺炎（COVID
‑
19）是由新冠病毒（SARS
‑
CoV
‑
2）引起的烈性传染病，目前仍然是非常严峻的全球性公共健康问题。为了掌握病毒的增殖和传播规律、开发快速可靠的检测和诊断方法、开发有效的治疗药物，需要多领域、大范围的科学家同病毒专家的大力协作、携手共进。虽然直接用新冠病毒进行研究测试，具有无可比拟的真实性，但必要的生物安全等级要求限制了很多实验，将大量的科研人员拒之门外。
[0003]在新冠病毒的表面，S蛋白（spike glycoprotein，刺突糖蛋白）是主要的衣壳蛋白。新冠病毒通过S蛋白的受体结合结构域（receptor binding domain，RBD）识别并结合宿主细胞表面受体（angiotensin converting enzyme 2，ACE2），介导病毒包膜与宿主细胞膜的融合过程。因而，S蛋白成为中和抗体和疫苗研发的主要靶点。目前，S蛋白和S蛋白的RBD受体结合结构域可以在大肠杆菌或真核细胞中重组表达，作为病毒的替代品。但是重组蛋白的制备需要较大量的人力成本，并且重组后蛋白分子的状态与S蛋白在病毒表面的真实情况会有较大差异，可能造成误导。
[0004]噬菌体是细菌的病毒。与动物病毒结构相似，噬菌体颗粒表面也是由衣壳蛋白构成，但噬菌体不感染动物细胞。噬菌体的安全性有多个实例为证。加州大学在2016年使用噬菌体疗法成功治愈了感染鲍曼不动杆菌的病人，并且美国FDA在2019年批准了一个静脉注射噬菌体治疗的临床试验。
[0005]M13噬菌体是一种常用的噬菌体，由大约2800多个P8蛋白组成的圆柱形衣壳包围住环状的单链DNA，在噬菌体的两端分别由P3蛋白和P6蛋白、P7蛋白和P9蛋白排布，这些衣壳蛋白不仅保护着噬菌体本身遗传信息的传递，还在噬菌体的组装、感染宿主菌等方面扮演着重要角色。噬菌体展示技术可以用M13噬菌体，将外源蛋白的基因与噬菌体衣壳蛋白（如P3蛋白）的基因融合，通过噬菌体衣壳蛋白，将外源蛋白展示在噬菌体表面。最常见的是用衣壳蛋白P3，也有用衣壳蛋白P7、P8或P9展示外源蛋白的成功案例。经过三十多年的发展，噬菌体展示技术已经广泛用于多肽和蛋白质的展示，用于抗体的淘选，具有操作简单、效率高、成本低等优点。

技术实现思路

[0006]本专利技术提供了一种将细菌病毒（如M13噬菌体）作为动物病毒（如新冠病毒）的替代物的技术方案。技术方案的原理是细菌病毒和动物病毒的构造相似，都有衣壳蛋白暴露于病毒颗粒表面；通过噬菌体展示技术，可以将动物病毒的衣壳蛋白通过融合蛋白的方式展示在细菌病毒表面。我们通过一个实例验证了该技术方案的可行性。具体的是将新冠病毒的衣壳蛋白（S蛋白）的RBD结构域与M13噬菌体衣壳蛋白（P9蛋白）融合，展示在M13噬菌体表
面，并且显示了与其特异抗体的结合能力。
[0007]本专利技术提供的技术方案是如下。
[0008]（1）选取动物病毒衣壳蛋白的顺序该顺序的选取要根据需要展示的抗原表位，和能够展示该抗原表位的三维结构的相对独立完整来决定。通过对动物病毒衣壳蛋白一级结构（氨基酸顺序）的同类蛋白比对和三级结构（冷冻电镜结构和晶体结构）的细致观察分析，选取合适的片段，作为融合蛋白中动物病毒衣壳蛋白的片段顺序。新冠病毒的S蛋白是典型的动物病毒衣壳蛋白，分为S1亚基和S2亚基两个相连的部分，S1部分中又分为N端区域（NTD）和C端区域（CTD）。受体结合结构域（RBD）位于C端区域内。S蛋白的冷冻电镜结构已经公开，可以从蛋白结构数据库（protein data bank，PDB）中得到，代码为：7e7d和7e7b。本专利技术的实例选取结构相对独立完整、参与受体结合的受体结合结构域的蛋白顺序，具体为R319
‑
K528。
[0009]（2）构建动物病毒衣壳蛋白与噬菌体衣壳蛋白融合的融合蛋白M13噬菌体的衣壳蛋白有五个，分别是P3、P6、P7、P8 和P9，各有特点。在融合蛋白的构建中，P3常用，P6、P7、P8和P9也有报道。融合的方式上，P3和P8可以在N端和C端融合，P6在C端融合，P7和P9都是在N端融合。本专利技术的实例是采用P9来构建融合蛋白，是将动物病毒衣壳蛋白顺序放在P9蛋白的N端融合，两者用一个短肽相连。短肽的要求是有较好的亲水性，不参与蛋白的二级结构、长短合适，因此，常用甘氨酸（Gly）与丝氨酸（Ser）的组合，如GGSGG的顺序。实例中，融合蛋白的顺序如SEQ ID NO: 1所示。类似的，P3、P6、P7和P8可以按同样的原理用来构建融合蛋白。
[0010]（3）构建表达融合蛋白的噬菌体质粒融合蛋白的顺序确定后，需要构建能够表达融合蛋白的噬菌体质粒。所述的噬菌体质粒上的两个必须的特征是：第一，有融合蛋白的基因，并能够表达融合蛋白；其次，含有噬菌体复制起点。融合蛋白基因的表达需要相应的启动子，常见的有乳糖启动子（lac promoter）、T7启动子（T7 promoter）、等。所述噬菌体质粒的结构如图1所示。
[0011]（4）产生展示动物病毒衣壳蛋白的噬菌体融合蛋白是通过噬菌体的衣壳蛋白展示在噬菌体颗粒表面。用构建好的噬菌体质粒转化大肠杆菌，适时诱导表达融合蛋白，加入辅助噬菌体产生展示动物病毒衣壳蛋白的M13噬菌体。所述噬菌体是本专利技术的一个重要目标产物。
[0012]（5）确认噬菌体展示的动物病毒衣壳蛋白的生物活性最好的方式确认动物病毒衣壳蛋白在噬菌体上展示的效果是功能测试。本专利技术构建了新冠病毒受体结合结构域与M13衣壳P9蛋白的融合蛋白，其生物活性可以用能与受体结合结构域特异性结合的抗体，采用酶联免疫法来验证。实施例中，实验验证了抗RBD抗体与展示衣壳蛋白受体结合结构域的噬菌体的结合能力，实验结果如图2所示。
[0013]衣壳蛋白位于病毒颗粒的表面，是中和抗体的靶点，是开发检测与诊断试剂以及疫苗的靶点。本专利技术技术方案产生的衣壳蛋白融合蛋白和展示融合蛋白的M13噬菌体，在病毒检测、疫苗研发、或诊断试剂和治疗药物的研发中有广泛的应用前景。
[0014]以新冠病毒为例，本专利技术提供的M13噬菌体受体结合结构域展示系统已经通过实验确认了展示的受体结合结构域具有特异抗体的结合能力，为研究受体结合结构域的结构与功能、受体结合结构域的突变对其结构与功能的影响等，提供了方便。本专利技术技术方案的
一个优点是在动物病毒衣壳蛋白片段基因的两端加上了限制性内切酶的位点，可以快速置换插入噬菌体衣壳蛋白的动物病毒衣壳蛋白片段。新冠状病毒自2019年初爆发以来，病毒在变异。本专利技术的一个应用是可以快速置换变异病毒的受体结合结构域片段，确定病毒变异对该蛋白片段功能的影响、研发适应变异病毒的对策。同样，本技术方案也适用于研究其他冠状病毒，如导致重症急性呼吸综合征（SARS）本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种融合蛋白，其特征是，病毒衣壳蛋白与M13噬菌体衣壳蛋白的融合。2.一种融合蛋白，其特征是，病毒衣壳蛋白与M13噬菌体衣壳P3，P6，P7，P8，或P9蛋白的融合，优选P9蛋白。3.根据权利要求1或2所述的融合蛋白，其特征是，病毒衣壳蛋白为新冠病毒的衣壳S蛋白的片段，优选S蛋白的RBD受体结合结构域；噬菌体衣壳蛋白为P9蛋白。4.根据权利要求3所述的融合蛋白，其特征是，所述病毒衣壳蛋白在N端，噬菌体衣壳蛋白在C端，由一个短肽GGSGG相连，所述RBDP9融合蛋白的...

【专利技术属性】
技术研发人员：白晓康，叶其壮，肖利群，
申请(专利权)人：广州明药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：