病原微生物宏基因组定量检测的内标分子、试剂盒以及方法技术

本发明专利技术涉及一种用于病原微生物宏基因组定量检测的内标分子，包括所述内标分子的试剂盒，以及应用。所述内标分子包所述内标分子包括至少3组，每组含有至少2条内标核酸序列，每组的核酸序列在使用时的总量至少存在2倍重量以上的差距。被发明专利技术通过建库时加入梯度的不同分组的内标分子，能够对病原微生物的DNA进行定量检测，减少样本用量，有效降低检测成本，且效果稳定可靠。效果稳定可靠。

【技术实现步骤摘要】
病原微生物宏基因组定量检测的内标分子、试剂盒以及方法


[0001]本专利技术涉及生物医药领域，特别是涉及病原微生物宏基因组定量检测的内标分子、试剂盒以及方法。

技术介绍

[0002]宏基因组(Metagenome)(也称微生物环境基因组Microbial Environmental Genome)。是由Handelsam等1998年提出的新名词，定义为“the genomes ot the total microbilta found in nature”，即生物环境中所有微小生物遗传物质的总和。目前宏基因组测序已经得到广泛的应用，如研究某种微生物的多样性(钟勇，基于宏基因组测序的扶桑绵粉蚧内共生菌多样性研究【J】Pingyang Customs,2020，29(4):273－278)、基于宏基因组测序研究环境中菌群的影响(郑微，宏基因组测序技术分析原发性肝癌患者肠道菌群特征【J】首都医科大学附属北京佑安医院临检中心，1674
‑
1358.2021.03.002)、感染性疾病诊断中的应用(LIU Wei
‑
ping,XIA Hui,TAO Zhi
‑
yong.The use of metagenomic sequencing technology to diagnose infectious diseases[J]Bengbu Medical College,2021May；16(5):614
‑
618)等。
[0003]呼吸道大部分微生物为常驻菌，只有达到一定丰度后才会有致病的风险，所以在呼吸道感染检测中除了定性检测外，定量也是指导医生准确诊断的重要指标。在宏基因组测序技术中，由于人源背景的影响，目前无法对样本中的微生物进行定量，因此实现宏基因组对病原微生物的定量具有重要的意义。目前对样本中微生物进行定量的方法主要有以下几种：
[0004]实时荧光定量PCR(RT
‑
PCR)：该方法是在PCR反应体系中加入与目的基因特异性结合的荧光探针，利用荧光信号累计实时监测整个PCR进程，最后通过扩增循环数与荧光信号的关系计算出目的基因的初始模板量。该方法特异性好，灵敏度高且可以定量计算出目的基因的量。目前应用于样本中抗原含量的定量，细菌丰度的研究，临床诊断的应用等。但是只能单一的对一种目的基因进行检测，无法确定目标基因的序列，并且只能检测已知目的基因以及可能漏检变异后的目标基因。
[0005]微滴式数字PCR(ddPCR)：该方法是将含有核酸分子的PCR反应体系“分割”成数量众多的、纳升级的反应单元，核酸分子在每个反应单元中随机分布，每个反应单元中包含0、1或者多个目标核酸分子,然后进行PCR扩增反应,PCR扩增结束后，对每个反应单元的荧光信号进行计数统计和分析，通过泊松分布和阳性个数比例计算出目标基因的初始量。该方法具有RT
‑
PCR的优点，并且可以对单核苷酸多态性、稀有突变和拷贝数变异进行分析。目前应用于器官移植物损伤评估，样本中病原微生物分子诊断，运用滴荧光振幅与扩增子大小之间的关系测定未知可扩增DNA分子的绝对浓度和长度。但是同样无法对样本内的全部微生物的所有基因进行分析，并且无法测出目的基因的序列。
[0006]全面检测、无偏好性的宏基因组二代测序(mNGS)在传染病诊断方面具有强大的优势，因为不需要特殊探针和靶向引物，从而有助于快速检测病原体。随着成本和时间的持续
NO.7
‑
SEQ ID NO.9；组4：SEQ ID NO.10
‑
SEQ ID NO.12；组5：SEQ ID NO.13
‑
SEQ ID NO.15。
[0026]在其中一些实施例中，上述组1至组5之间的核酸分子的总量为依次8
‑
12倍的梯度递进，更优选为依次10倍的梯度递进。
[0027]在其中一些实施例中，5组中所述内标分子的用量分别为，组1为1ng，组2为0.1ng，组3为0.01ng，组4为0.001ng，组5为0.0001ng。在实际应用上，上述用量数据会有正常的误差，但依然在本专利技术的保护范围中。
[0028]本专利技术的另一目的提供一种病原微生物宏基因组定量检测试剂盒。
[0029]所述病原微生物宏基因组定量检测试剂盒，包括有上述内标分子，或者制备上述内标分子的试剂。
[0030]在其中一些实施例中，所述制备上述内标分子的试剂包括用以扩增内标分子的扩增引物。
[0031]在其中一些实施例中，优选为所述内标分子的包括SEQ ID NO.1
‑
SEQ ID NO.15序列中的至少9条，进一步，其所述扩增引物根据分组，分别选自如SEQ ID NO.16
‑
SEQ ID NO.45所示。
[0032]本专利技术的另一目的是提供一种病原微生物宏基因组定量检测方法。
[0033]包括以下技术方案。
[0034]一种病原微生物宏基因组定量检测方法，包括步骤如下：
[0035]1)获得在待检测样本；
[0036]2)对待检测样本进行DNA提取，得到DNA样本，或进行样本的DNA提取，得到DNA样本，再进行逆转录，得到RNA样本；
[0037]3)对得到的DNA样本或RNA样本加入上述内标分子(即各组核酸序列的混合液)，进行宏基因组文库构建；
[0038]4)进行测序和对测序结果的生物信息分析，得到病原微生物以及15种内标分子的种水平靶标检出数。
[0039]5)根据不同梯度的内标分子的靶标检出数的对数对应的投入量的对数绘制标准曲线，得到线性公式。
[0040]6)把病原微生物的种水平靶标检出数的对数代入线性公式中，得到的结果进行公式换算得到病原微生物的理论拷贝数。
[0041]本专利技术的另一目的是提供一种病原微生物宏基因组定量检测的标准曲线的建立方法，包括步骤如下：
[0042]1)获得核酸样本；
[0043]2)加入预混好的上述内标分子于核酸样本中，进行宏基因组文库构建；所述内标分子包括至少3组，组与组之间的内标分子的核酸总量具有梯度递进关系；
[0044]3)通过高通量测序与生信流程得到至少3个梯度的内标分子的检出序列数；对至少3个梯度的内标分子对应的序列检出数与投入量取对数；
[0045]使用y＝ax+b这个线性模型，x等于取对数后的内标序列检出数，y等于取对数后的内标投入量，将至少3个梯度的内标数据拟合成一条平滑的曲线；通过该曲线得到一条反映不同梯度时投入量与序列数关系的线性公式：
[0046]log
10 C
is
＝α
·
log
10 R
is
+β
[0047]根据病原微生物与内标的相关性得到病原微生物的投入量与序列数关系的线性公式：
[0048]log
10 C
本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.用于病原微生物宏基因组定量检测的内标分子，其特征是，包括至少6条核酸序列，每条序列的长度在1000
±
200bp范围内，每条序列组成为自然界中唯一序列，每条序列的GC含量在35％
‑
70％范围内，每条序列无微卫星序列，每条序列连续相同碱基序列数小于4；且使用时所述内标分子包括至少3组，每组含有至少2条上述核酸序列，每组的核酸序列总量至少存在2倍重量以上的差距。2.根据权利要求1所述的用于病原微生物宏基因组定量检测的内标分子，其特征是，所述内标分子的序列长度为1000
±
50bp，GC含量为45
‑
55％3.根据权利要求1所述的用于病原微生物宏基因组定量检测的内标分子，其特征是，所述内标分子有3
‑
8组，进一步优选为4
‑
6组。4.根据权利要求1所述的用于病原微生物宏基因组定量检测的内标分子，其特征是，每组含有2
‑
5条核酸序列，更优选为3条。5.根据权利要求1所述的用于病原微生物宏基因组定量检测的内标分子，其特征是，在使用时，组与组之间的核酸序列的总量具有5倍以上的梯度递进，优选为组与组之间的核酸序列的总量为8
‑
12倍的梯度递进，更优选为10倍的梯度递进。6.根据权利要求1
‑
5任一所述的用于病原微生物宏基因组定量检测的内标分子，其特征是，所述内标分子包括SEQ ID NO.1
‑
SEQ ID NO.15所示序列。7.根据权利要求6所述的用于病原微生物宏基因组定量检测的内标分子，其特征是，所述内标分子分成五组；优选地，所述五组中序列组成分别为组1：SEQ ID NO.1
‑
SEQ ID NO.3；组2：SEQ ID NO.4
‑
SEQ ID NO.6；组3：SEQ ID NO.7
‑
SEQ ID NO.9；组4：SEQ ID NO.10
‑
SEQ ID NO.12；组5：SEQ ID NO.13
‑
SEQ ID NO.15。8.根据权利要求7所述的用于病原微生物宏基因组定量检测的内标分子，其特征是，组1至组5之间的核酸序列的总量为依次8
‑
12倍的梯度递进，更优选为依次10倍的梯度递进。9.一种病原微生物宏基因组定量检测试剂盒，其特征是，包括有权利要求1
‑
8任一项所述的内标分子，或者制备权利要求1
‑
8任一项所述的内标分子的试剂。10.根据权利要求9所述的所述病原微生物宏基因组定量检测试剂盒，其特征是，制备权利要求1
‑
8任一项所述的内标...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄津，李英镇，袁剑颖，王胡海灵，蒲康泽，郭凤明，陈嘉昌，柳俊，胡朝晖，
申请(专利权)人：广州市金圻睿生物科技有限责任公司，
类型：发明
国别省市：