一种中华绒螯蟹螺原体MIRA和MIRA-LFD检测方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种中华绒螯蟹螺原体MIRA和MIRA

【技术实现步骤摘要】
一种中华绒螯蟹螺原体MIRA和MIRA
‑
LFD检测方法及其应用


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一种中华绒螯蟹螺原体MIRA和MIRA
‑
LFD检测方法及其应用。

技术介绍

[0002]中华绒螯蟹（俗称河蟹）在中国的淡水养殖业中占有重要地位，其经济价值和营养价值较高。随着中华绒螯蟹养殖快速、大规模的发展，致使水体环境状况急剧恶化，病害经常发生且越来越严重，其中较为严重的病害就是河蟹“颤抖病”，其对中华绒螯蟹的养殖产业造成了巨大的损失。近些年来，对于河蟹颤抖病的发病机制一直尚不明确，有的认为是病毒，有的认为是细菌以及生存环境起重要作用，还有人提出其病原体为类立克次体微生物，直到2003年王文等首次从发病的中华绒螯蟹中分离出病原，经系统分类学、血清学等方面的研究，将其命名为中华绒螯蟹螺原体（Spiroplasma eriocheiris, Se）。
[0003]目前针对中华绒螯蟹螺原体的检出常用的检测方法有蛋白质印迹法、普通PCR、RT
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PCR和LAMP，但这些方法存在容易污染、操作繁琐、敏感性中等、存在非特异性扩增、耗时长、需要专业仪器设备等缺点。因此亟需一种操作简单，特异性强的中华绒螯蟹螺原体检测方法。

技术实现思路

[0004]为解决上述问题，本专利技术公开了一种中华绒螯蟹螺原体MIRA和MIRA
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LFD检测方法及其应用，MIRA技术对样本及实验室环境要求较低，可将少量核酸分子扩增至可检出水平，结合侧流层析试纸条（LFD）形成 MIRA
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LFD快速诊断方法；同时，中华绒螯蟹螺原体MIRA、MIRA
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LFD的方法还具有高度的特异性，在灵敏度的表现上也更强于PCR；同时中华绒螯蟹螺原体的MIRA、MIRA
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LFD的检测方法具有快速、灵敏、特异性强、不需要特殊仪器等优点，适合中华绒螯蟹螺原体的快速检测，可以适用于临床样品检测。
[0005]为达到上述目的，本专利技术的技术方案如下：一种中华绒螯蟹螺原体MIRA和MIRA
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LFD检测方法，包括以下步骤：S1.引物和探针的合成与筛选；S2.MIRA反应体系的建立；S3.MIRA
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LFD反应体系的建立；S4.特异性检测。
[0006]作为本专利技术的一种改进，所述步骤S1的具体操作步骤如下：（1）设计引物：使用30
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35bp的引物，无二级结构，扩增片段大小150
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300bp，通过Olige6软件设计4对引物；（2）初步筛选：在上下游引物中间，设计一长度为46
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52nt与目的片段互补的序列，5端修饰一个FAM，在5
’
端与3
’’
端的中部位置标记一个dSpacer（四氢呋喃，THF），作为nfo的识别位点，3
’
末端标记一个修饰基团（C3spacer），通过Olige6软件设计出2对探针引物；
（3）最终筛选：将两组引物进行最后筛选，最终得出1组片段大小约为186bp与预期大小一致的292F/446R引物用于后续MIRA方法检测，并以此片段设计出一组探针引物用于后续MIRA
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LFD方法检测。
[0007]作为本专利技术的一种改进，所述步骤S2的具体操作步骤如下：（1）建立25μL的MIRA反应体系，向冻干混合酶中加入29.4μL溶解缓冲液（A Buffer），将其均分为2份；（2）向每份加入中华绒螯蟹螺原体DNA 1μL，无菌无酶水6.05μL、10μmol/L的正向引物1μL、10μmol/L的反向引物1μL、醋酸镁（B Buffer）1.25μL；（3）将混合物混匀，震荡1s离心1s，重复两次，立即放到水浴锅中反应，得到MIRA产物；（4）将MIRA产物通过酚：氯仿：异丙醇=25：24：1进行抽提，随后用2%琼脂糖凝胶电泳进行分析。
[0008]作为本专利技术的一种改进，所述步骤S3的具体操作步骤如下：（1）建立25μL的MIRA
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LFD反应体系，向冻干混合酶中加入29.4μL溶解缓冲液（A Buffer），将其均分为2份；（2）向每份加入中华绒螯蟹螺原体DNA 1μL，无菌无酶水6.85μL，1μmol/L的正向引物0.5μL、1μmol/L的反向引物0.5μL、醋酸镁（B Buffer）1.25μL；（3）将混合物混匀，震荡1s离心1s，重复两次，立即放到水浴锅中反应，得到MIRA
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LFD产物；（4）取10μL反应产物于20μL的PCR小管中，向其加入95μL的无菌无酶水，混匀，将侧向层析纸条插入，静置5min后观察结果。
[0009]作为本专利技术的一种改进，所述步骤S4的具体操作步骤如下：用筛选的最佳引物与一定反应条件，分别以枯草芽孢杆菌、苏云金杆菌、金黄葡萄球菌、大肠杆菌、嗜水气单胞菌、沙门氏杆菌、中华绒螯蟹螺原体的DNA为模板，同时设置了一个空白对照，进行MIRA、MIRA
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LFD检测。
[0010]作为本专利技术的一种改进，所述反应条件具体为：MIRA、MIRA
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LFD的反应温度为37℃、反应时间为10min。
[0011]本专利技术还提供了上述检测方法在中华绒螯蟹螺原体中的应用。
[0012]本专利技术还提供了上述检测方法在临床样品检测中的应用。
[0013]本专利技术的有益效果为：本专利技术建立了一种MIRA、MIRA
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LFD检测方法，无需特殊仪器且具有快速、灵敏、特异性强等优点，可用于检测中华绒螯蟹是否携带病原螺原体，及时采取措施，避免病原扩散，减少其对中华绒螯蟹养殖造成的损失，从而促进中华绒螯蟹养殖产业的健康发展。
附图说明
[0014]图1为本专利技术的引物筛选，其中：
“‑”
表示以无菌水为模板的阴性对照，“+”表示以中华绒螯蟹螺原体为模板，阳性对照为试剂盒自带模板与引物。
[0015]图2为本专利技术的MIRA反应温度及时间的优化，其中：a为反应温度优化，b为反应时间优化。
[0016]图3为本专利技术的MIRA
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LFD反应温度及时间的优化，其中：a为反应温度优化，b为反应时间优化。
[0017]图4为本专利技术的引物特异性检测，其中：line1
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7分别为中华绒螯蟹螺原体、枯草芽孢杆菌、苏云金杆菌、金黄葡萄球菌、大肠杆菌、嗜水气单胞菌、沙门氏杆菌；b:line1
‑
8分别为无菌水、枯草芽孢杆菌、苏云金杆菌、金黄葡萄球菌、大肠杆菌、嗜水气单胞菌、沙门氏杆菌、中华绒螯蟹螺原体。
[0018]图5为本专利技术的灵敏性检测，其中：a为MIRA检测，b为MIRA
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LFD检测，c为PCR检测，Line1
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9所用中华绒螯蟹螺原体DNA浓度分别为10ng
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μL<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种中华绒螯蟹螺原体MIRA和MIRA
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LFD检测方法，其特征在于，包括以下步骤：S1.引物和探针的合成与筛选；S2.MIRA反应体系的建立；S3.MIRA
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LFD反应体系的建立；S4.特异性检测。2.根据权利要求1所述的一种中华绒螯蟹螺原体MIRA和MIRA
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LFD检测方法，其特征在于：所述步骤S1的具体操作步骤如下：（1）设计引物：使用30
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35bp的引物，无二级结构，扩增片段大小150
‑
300bp，通过Olige6软件设计4对引物；（2）初步筛选：在上下游引物中间，设计一长度为46
‑
52nt与目的片段互补的序列，5端修饰一个FAM，在5
’
端与3
’’
端的中部位置标记一个dSpacer（四氢呋喃，THF），作为nfo的识别位点，3
’
末端标记一个修饰基团（C3spacer），通过Olige6软件设计出2对探针引物；（3）最终筛选：将两组引物进行最后筛选，最终得出1组片段大小约为186bp与预期大小一致的292F/446R引物用于后续MIRA方法检测，并以此片段设计出一组探针引物用于后续MIRA
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LFD方法检测。3.根据权利要求1所述的一种中华绒螯蟹螺原体MIRA和MIRA
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LFD检测方法，其特征在于：所述步骤S2的具体操作步骤如下：（1）建立25μL的MIRA反应体系，向冻干混合酶中加入29.4μL溶解缓冲液（A Buffer），将其均分为2份；（2）向每份加入中华绒螯蟹螺原体DNA 1μL，无菌无酶水6.05μL、10μmol/L的正向引物1μL、10μmol/L的反向引物1μL、醋酸镁（B Buffer）1.25μL；（3）将混合物混匀，震荡1s离心1s，重复两次，立即放到水...

【专利技术属性】
技术研发人员：孟庆国，安德瑞，宫思楠，黄燕兰，顾伟，王文，
申请(专利权)人：南京师范大学，
类型：发明
国别省市：