基于LAMP-CRISPR/Cas12a系统宋内氏志贺氏菌的快速检测方法技术方案

本发明专利技术提供一种基于CRISPR/Cas12a系统结合环介导等温扩增(LAMP)快速检测宋内氏志贺氏菌的方法，属于微生物检测领域。本发明专利技术利用CRISPR系统Ⅱ类

【技术实现步骤摘要】
基于LAMP
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CRISPR/Cas12a系统宋内氏志贺氏菌的快速检测方法


[0001]本专利技术涉及病原微生物检测
，具体涉及基于LAMP
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CRISPR/Cas12a系统宋内氏志贺氏菌的快速检测方法。

技术介绍

[0002]志贺氏菌属是一类目前最常见的导致细菌性痢疾的食源性病原菌。宋内氏志贺菌是痢疾流行的主要病原菌之一。人们误食了宋内氏志贺菌污染的食物，引起发热、腹痛、腹泻等症状，其所引起的肠道传染病，发病率居传染病之首。
[0003]检验方法包括样本采集、前增菌、标本混合及DNA制备、实时荧光定量PCR、对结果呈阳性的混合标本还需做进一步确认，包括增菌、分离培养、菌株鉴定、血清学检验、操作程序复杂，用到如PCR仪等多种昂贵仪器，检测价格昂贵。其中急性中毒型细菌性痢疾还会容易误诊，在出现大范围病原菌感染时，很难实现快速检测。传统检测宋内氏志贺菌的方法，费时、费力，已不能适应社会的快速发展。
[0004]核酸体外扩增技术是对传统检测方法的补充，相关技术被广泛应用于食源性致病菌检测。比如本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.基于LAMP
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CRISPR/Cas12a系统宋内氏志贺氏菌的快速检测方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)提取待测样品的基因组DNA；(2)针对特异致病基因保守序列设计sgRNA，包含sgRNA的PCR引物，采用PCR结合LbCpfl酶切方法筛选得到目标sgRNA；(3)设计LAMP引物，以步骤(1)提取的基因组DNA作为模板，进行LAMP扩增；(4)以步骤(1)提取的基因组DNA作为模板，步骤(2)设计的PCR引物，扩增特异致病基因IpaH，构建至pMD
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19T克隆载体，构建pMD19T
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IpaH质粒；以十倍比例倍比稀释质粒作为LAMP扩增的模板；(5)荧光可视检测，将LAMP扩增产物、LbCpf1、荧光探针、目标sgRNA、NEB Buffer2.1混匀，孵育10～30min，在蓝光或紫外光下裸眼可视对样品中宋内氏志贺氏菌的定性检测。2.根据权利要求1所述的基于LAMP
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CRISPR/Cas12a系统宋内氏志贺氏菌的快速检测方法，其特征在于，所述步骤(2)中设计的sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：1
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7所示；包含sgRNA序列的宋内氏志贺氏菌特异致病基因IpaH基因前向和后向引物组的核苷酸序列如SEQ ID NO：8、9所示，用于普通PCR，结合LbCpf1酶切筛选得到目标sgRNA。3.根据权利要求1所述的基于LAMP
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CRISPR/Cas12a系统宋内氏志贺氏菌的快速检测方法，其特征在于，所述步骤(3)中设计的LAMP引物，包含针对目标sgRNA序列的宋内氏志贺氏菌特异致病基因IpaH靶标序列的引物组，其中包括外引物F3，F3的核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示；外引物B3，B3的核苷酸序列如SEQ ID NO：11所示；内引物FIP，FIP的核苷酸序列如SEQ ID NO：12所示；内引物BIP，BIP的核苷酸序列如SEQ ID NO：13所示；环引物LF，LF的核苷酸序列如SEQ ID NO：14所示；环引物LB，LB的核苷酸序列如SEQ ID NO：15所示。4.根据权利要求1所述的基于LAMP
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CRISPR/Cas12a系统宋内氏志贺氏菌的快速检测方法，其特征在于，所述步骤(3)中设计的LAMP的扩增体系为25μL体系，1.6μM内引物1和内引物2，0.2μM外引物1和外引物2，0....

【专利技术属性】
技术研发人员：李聪聪，姜东凤，刘玲玲，吴姣，霍永，王昊鹏，徐永杰，杨一帆，李新锋，徐秋良，陶大刚，谢胜松，
申请(专利权)人：河南牧业经济学院，
类型：发明
国别省市：