用于检测结核分枝杆菌的LAMP引物组、试剂盒和方法技术

本发明专利技术公开了一种用于检测结核分枝杆菌的LAMP引物组、试剂盒和方法，该LAMP引物组包括：外引物对、内引物对和环引物对；其中，外引物对包括F3和B3，F3的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，B3的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；内引物对包括FIP和BIP，FIP的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，BIP的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；环引物对包括LF和LB，LF的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，LB的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示。利用该LAMP引物组进行环介导等温扩增反应，其检测具有快速、灵敏、特异性强等特点，结果可靠稳定。结果可靠稳定。结果可靠稳定。

【技术实现步骤摘要】
用于检测结核分枝杆菌的LAMP引物组、试剂盒和方法


[0001]本专利技术涉及生物
，具体而言，涉及一种用于检测结核分枝杆菌的LAMP引物组、试剂盒和方法。

技术介绍

[0002]根据世界卫生组织的一份报告，全世界三分之一的人感染结核分枝杆菌。该菌的感染使得感染者的临床情况变得更加糟糕。所以，从临床标本中检测结核杆菌对感染者的治疗和控制非常重要。
[0003]然而，传统的细菌学方法非常耗时，因为结核分枝杆菌需要6
‑
8周才能生长。基于分子的方法，包括聚合酶链式反应(PCR)，等温扩增(SAt，LAMP，RPA，RAA等),分子杂交(MH)等，方法更灵敏，而且大大减少检测所需的时间(几个小时到一天内)。分子检测方法还可以检测、鉴定直接来自临床的标本以及实验室分离培养的菌株。这些分子检测方法中，已经描述了检测结核分枝杆菌的不同靶点，包括编码32kDa、38kDa和65kDa抗原的groEl、mtb
‑
4和dnaJ基因，插入序列，16S
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23S间隔区热休克蛋白(hsp)65编码基因和16S rRNA。IS986和IS6110是大多数结核分枝杆菌中最常见的重复元件，在菌株中有10
‑
16个拷贝。其中，IS6110比IS986更敏感并且更特异。IS6110被认为是检测结核分枝杆菌的有用的靶标。然而，该靶标在牛分枝杆菌中的存在可导致假阳性结果。此外，据报道一些结核分枝杆菌菌株缺乏这种成分，则可能导致假阴性结果。
[0004]目前常规检测方法有：通过形态学区别鉴定来检测，由于实际操作时痰中成分各异，如果不是经验丰富的检测者，有时很难制备出合乎检测使用的痰片并染色；对痰涂片进行抗酸染色，由于在显微镜下观察到红色短杆菌为阳性，而染色阳性只能说明抗酸杆菌存在，不能区分于其他抗酸染色阳性菌，尤其是不能区分结核菌与非结核分枝杆菌；分离培养法，虽然其灵敏度高于涂片镜检法，但是培养周期长达6
‑
8周。
[0005]鉴于此，特提出本专利技术。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的在于提供一种用于检测结核分枝杆菌的LAMP引物组、试剂盒和方法，利用该LAMP引物组进行环介导等温扩增反应，其检测具有快速、灵敏、特异性强等特点，结果可靠稳定。
[0007]本专利技术是这样实现的：
[0008]第一方面，本专利技术提供了一种用于检测结核分枝杆菌的LAMP引物组，其包括：外引物对、内引物对和环引物对；
[0009]其中，所述外引物对包括F3和B3，F3的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，B3的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；
[0010]所述内引物对包括FIP和BIP，FIP的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，BIP的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；
[0011]所述环引物对包括LF和LB，LF的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，LB的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示。
[0012]本专利技术提供的用于检测结核分枝杆菌的LAMP引物组，是以结核分枝杆菌特有的细胞色素P450(CYP 141基因)作为靶基因进行扩增，针对CYP141基因，本专利技术设计了F3、B3、FIP、BIP、LF和LB这三对引物，这三对引物能特异性识别待检测模板的靶基因序列的特定区域，在一定温度条件下即可进行环介导等温扩增，产物可直接通过颜色辨别，不需要PCR仪等精密仪器。且CYP 141基因不存在于牛结核分枝杆菌，所以对卡介苗(BCG)和牛结核分枝杆菌(Mycobacterium bovis)无扩增反应，而且对非结核分支杆菌不扩增，特异性高。因此利用上述LAMP引物组检测结核分枝杆菌，其操作简便，灵敏度高，特异性强，用时少，成本低。
[0013]第二方面，本专利技术还提供了一种用于检测结核分枝杆菌的试剂盒，该试剂盒中包括上述LAMP引物组。
[0014]各引物的添加量及其比例关系均会对扩增结果产生影响，为了得到的扩增结果更易于辨别，优选地，本专利技术中外引物对、内引物对与环引物对的摩尔比为1:8:4。
[0015]在一些实施例中，上述试剂盒还包括dNTPs、PCR缓冲液和Bst DNA聚合酶中的一种或多种。
[0016]其中，本专利技术用Bst DNA聚合酶代替常规PCR的DNA聚合酶，该酶耐高温，有链置换功能和DNA 5
’→3’
聚合活性，在60
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65℃等温条件下对靶DNA实现特异扩增；由于不需要高温变性、低温退火和延伸的循环，省去了常规PCR变温所需要的时间，从而实现快速高效的DNA扩增。
[0017]在一些实施例中，PCR缓冲液包括：Tris
‑
HCl，MnCl2，(NH4)2SO4，MgSO4，Tween 20、甜菜碱和指示剂。
[0018]上述试剂盒中的指示剂选自DNA指示剂或金属离子指示剂。本专利技术对采用DNA指示剂还是金属离子指示剂不做限定，上述DNA指示剂指荧光指示剂，可以是Syto 9；上述金属离子指示剂可以是钙黄绿素或羟基萘酚蓝。
[0019]第三方面，本专利技术提供了一种检测结核分枝杆菌的方法，其包括使用上述引物组或试剂盒对待测样本进行环介导等温扩增反应，扩增反应结束后通过颜色变化进行结果判定。
[0020]上述环介导等温扩增反应的反应过程如图1所示：
[0021]FIP引物与靶DNA的F2区杂交，合成互补链，LAMP反应开始(图1B)；Bst DNA聚合酶(有链置换功能)将FIP引物合成的互补链与外部引物(F3或B3)的延伸链置换(图1C)；FIP引物合成的互补链释放，并成为BIP引物的模板(图1C)；一个哑铃形的DNA形成(图1D)，该哑铃状DNA作为模板进入LAMP循环(图1D)。LF则作为另一条引物同时进入循环扩增直至反应结束。最终产物是由不同长度的具有链干
‑
环结构的DNA分子(stem
‑
loop DNAs)组成的混合物。
[0022]在本专利技术中，上述扩增反应的25μL反应体系为：Tris
‑
HCl(pH＝7.1)的终浓度为10mM，KCl的终浓度为50mM，MnCl2的终浓度为10mM，指示剂的终浓度为10mM，MgSO4的终浓度为8mM，EDTA的终浓度为0.1mM，DTT的终浓度为1mM，Triton X
‑
100的终浓度为0.1％，甘油的终浓度为2％，甜菜碱的终浓度为0.8M，外引物对的终浓度为0.2μM，内引物对的终浓度为
1.6μM，环引物对的终浓度为0.8μM，dNTPs的终浓度为1.4mM，Bst DNA聚合酶的终浓度为8U/μL，以及5μL DNA样品。
[0023]如图2和图3所示，当指示剂为钙黄绿素时，在可见光下，颜色显示淡黄色，表示阳性，颜色显示淡粉色，表示阴性；在紫外光下，颜色显示绿色荧光，表示阳性，颜色显示无荧光，表示阴性。
[0024]本专利技术本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于检测结核分枝杆菌的LAMP引物组，其特征在于，所述LAMP引物组包括：外引物对、内引物对和环引物对；其中，所述外引物对包括F3和B3，F3的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，B3的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；所述内引物对包括FIP和BIP，FIP的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，BIP的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；所述环引物对包括LF和LB，LF的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，LB的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示。2.一种用于检测结核分枝杆菌的试剂盒，其特征在于，其包括含有权利要求1所述的LAMP引物组的LAMP反应液。3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述LAMP反应液中所述外引物对、内引物对与环引物对的摩尔比为1:8:4。4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括dNTPs、PCR缓冲液和Bst DNA聚合酶中的一种或多种。5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述PCR缓冲液包括：Tris
‑
HCl，MnCl2，(NH4)2SO4，MgSO4，Tween 20、甜菜碱和指示剂。6.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述指示剂选自DNA指示剂或金属离子指示剂；优选地，所述DNA指示剂包括Syto 9；优选地，所述金属离子指示剂包括羟基萘酚蓝和钙黄绿素。7.一种检测结核分枝杆菌的方法，其特征在于，所述方法为非疾病诊断目的，...

【专利技术属性】
技术研发人员：张洪英，朱银银，
申请(专利权)人：南京市疾病预防控制中心，
类型：发明
国别省市：