用于耐药性筛选的方法和组合物技术

本公开涉及新型引物，以及它们用于检测来自疑似或确诊结核病的受试者的样品中的耐药突变的存在的用途。突变的存在的用途。突变的存在的用途。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于耐药性筛选的方法和组合物


[0001]本申请所涉及的专利技术是一种新的诊断方法和引物和/或药物敏感性测试(DST)试验。尤其地，本专利技术涉及新型引物和它们在识别和/或检测来自疑似或确诊结核病的受试者的样品中的耐药性突变的存在的方法中的用途。

技术介绍

[0002]分枝杆菌和结核病
[0003]主要由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)
1,2
导致的结核病(TB)是对全球健康有影响的疾病3–5。在结核分枝杆菌复合群(MTBc)中结核分枝杆菌和相关细菌出现于至少11000年前，并且自那时起一直与它们的宿主共同进化
6,7
。这一历史导致了高传染性细菌分类群，其在它们的宿主中长期存在并且具有先进的免疫系统逃逸方法7。
[0004]由于这种共同进化，现代结核分枝杆菌(M.tuberculosis)和MTBc的成员共有许多特征，并且与非结核分枝杆菌(NTM)群
7,8
的成员共同存在于每个已知环境中(极地区域除外)。MTBc由10种能够在它们的宿主中导致TB或类似TB的疾病的分枝杆菌组成，其中三种专属人类的TB物种是狭义结核分枝杆菌、卡氏分枝杆菌(Mycobacterium canettii)和非洲分枝杆菌(Mycobacterium africanum)
1,7,9
。此外，从牛(牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis))、山羊和绵羊(Mycobacterium caprae)、海豹和海狮(Mycobacterium pinnipedii)和啮齿动物(田鼠分枝杆菌(Mycobacterium microti))传播到人类，反之亦然的人畜共患TB的传播被充分证实
4,6,7
。目前，新增了三个物种，牛和羚羊中的Mycobacterium orygis
7,10
、狐獴中的Mycobacterium suricattae
7,11
和獴科中的Mycobacterium mungi
7,12
。
[0005]目前的研究发现，MTBc成员是高度基因同质的，具有高达99.7％的核苷酸同源性，并且具有相同的16S序列7。MTBc成员主要是克隆的，具有较少水平基因转移，这使得在遗传水平上很难区分不同物种，也不可能采用显微镜法
2,4
,
6,13
。
[0006]分枝杆菌是革兰氏阳性抗酸杆菌，约2μm长，其主要通过气溶胶传播；它们是完全在细胞内的，并且在它们特有的宿主之外没有已知的环境库
1,7,14
。富含脂质的细胞壁和肽聚糖层、脂聚糖层、分枝菌酸层和蜡质层形成极其顽强的微生物
7,14
。许多分枝杆菌和MTBc的全部成员的典型特征是在培养基中和体内挑剔并且生长速度缓慢
2,6,15,16
。
[0007]结核病最常表现为肺部疾病(约80％的情况)，尽管肺外和弥散性疾病的形式也有发生
1,2,17
。分枝杆菌疾病对全球中低收入和发展中国家(LMICs)造成高疾病负担
3,6,18
。据世界卫生组织(WHO)估计，三分之一的人口携带潜伏性TB(LTBI)，每年有900万至1100万例TB病例
19
。全球每年死于TB的人数估计在150万至200万，这使得TB成为感染相关死亡的最大单一威胁
6,20,21
。
[0008]分枝杆菌耐药性
[0009]WHO定义耐药性为微生物对曾经能够治疗该微生物感染的抗菌药物的抵抗力。TB的耐药性(DR)菌株的出现很大程度上是治疗方案的不一致实践、延迟治疗和/或患者在长期治疗过程中违约的结果，这导致耐药性的阳性选择和宿主间抗性菌株转移的更高发生
率
3,22,23
。
[0010]目前有几种类型的耐药性TB：多重耐药(MDR)型，其至少对利福平和异烟肼有耐药性；广泛耐药(XDR)型，其增加了对任何氟喹诺酮类药物和至少一种二线注射用药有耐药性，超出了在MDR中发现的耐药性；极端耐药(XXDR)型，其对所有一线和二线药物有耐药性；和全耐药(TDR)型，其对目前所有TB药物有耐药性
16,24
。此外，在MTBc中的一些物种具有谱系特有的内在耐药性，例如牛分枝杆菌(M.bovis)和卡氏分枝杆菌(M.canettii)，如果其被误诊会使得控制耐药性的方法复杂化
2,22,24
。
[0011]耐药性TB(DR
‑
TB)随着发病率的增加成为全球日益严重的问题
21
,22
,25
。令人担忧的是，耐药菌株将逆转在消灭TB方面取得的进展
6,22,23
。过去十年，全球范围内耐药TB的发病率增加了至少10倍，2009年仅4.9％的患者表现出耐药性，而2018年为51％
19
。在2018年，全球约1050万TB病例有近500000例是MDR，并且其中有31000(6.2％)是XDR
19
。
[0012]MDR
‑
TB是最常见的耐药性类型
16,24
。MDR被定义为对异烟肼和利福平有耐药性的TB菌株
25
。MDR
‑
TB菌株通常采用WHO认可的传统药物方案治疗，该方案需要6个月的一线和二线抗生素疗程。XDR
‑
TB是增加对任何氟喹诺酮类和阿米卡星、卷曲霉素或卡那霉素的二线药物的耐药性的MDR菌株
25,26
。治疗XDR
‑
TB的具体方案的选择可以在可行的情况下通过培养基或分子(例如基因型MTBDRsl
‑
Bruker)药物敏感性测试(DST)试验
6,26,27
进行指导。由于在诊断和治疗TB的MDR菌株和XDR菌株中的困难，这些病例的死亡率很高，MDR的死亡率约为50％，XDR
‑
TB感染的死亡率超过70％
25
。
[0013]针对TB的一线治疗是抗生素的组合；利福平、异烟肼、乙胺丁醇和吡嗪酰胺使用超过6个月。对这些抗生素治疗方法的耐药性导致二线抗生素的使用(氟喹诺酮类药物、阿米卡星、卷曲霉素和卡那霉素)，其效果更差并且毒性更大
24,25
。这些治疗方法通常需要注射，这需要更先进的医疗设备和对治疗的监督
24
。
[0014]分枝杆菌中的耐药性是突变的，而不是可转移的，在过去十年中，许多单核苷酸多态性(SNP)已经被报道与耐药性相关。然而，不是所有都在文献中有充足的证据来支持这种关联。世界卫生组织(WHO)和其他组织将已经报道的耐药性SNP分为高、中和低置信等级
28,29
。
[0015]下一代靶向测序
[0016]WHO宣布了本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种或多种寡核苷酸引物集，所述一种或多种寡核苷酸引物集用于扩增来自结核分枝杆菌(M.tuberculosis)复合群中的结核分枝杆菌和/或相关细菌的一种或多种基因的部分，所述一种或多种基因选自包括eis、embB、ethA、fabG1、gidB、gyrA、inhA、katG、pncA、rrl、rplC、rpoB、rpsL、rrs、rv0678和tlyA中的一种或多种的组，其中，每个集包括特异于所述部分的一对正向和反向引物，其中，每个引物具有如在SEQ ID No.1
‑
32所示的序列。2.根据权利要求1所述的一种或多种寡核苷酸引物集，所述一种或多种寡核苷酸引物集用于多重PCR，其中，所述引物集被分为一个或多个多重组，其中，所述多重组包括用于扩增以下项的部分的正向和反向引物对：(a)eis、embB、rrs、rv0678和fabG1；(b)gyrA、rpoB、ethA、rplC和katG；和/或(c)gidB、inhA、rrl、pncA、rpsL和tlyA。3.根据权利要求1或2所述的一种或多种寡核苷酸引物集，所述一种或多种寡核苷酸引物集用于多重PCR并且被分为一个或多个多重组，其中，所述一个或多个多重组包括：(a)SEQ ID No.1和2；3和4；5和6；7和8；以及9和10(表7中的第1组)中的一种或多种；(b)SEQ ID No.11和12；13和14；15和16；17和18；以及19和20(表7中的第2组)中的一种或多种；和/或(c)SEQ ID No.21和22；23和24；25和26；27和28；29和30；以及31和32(表7中的第3组)中的一种或多种。4.根据权利要求3所述的用于多重PCR的寡核苷酸引物集组，其由SEQ ID No.1和2；3和4；5和6；7和8；以及9和10(表7中的第1组)组成。5.根据权利要求3所述的用于多重PCR的寡核苷酸引物集组，其由SEQ ID No.11和12；13和14；15和16；17和18；以及19和20(表7中的第2组)组成。6.根据权利要求3所述的用于多重PCR的寡核苷酸引物集组，由SEQ ID No.21和22；23和24；25和26；27和28；29和30；以及31和32(表7中的第3组)组成。7.根据权利要求1
‑
6中任一项所述的一种或多种寡核苷酸引物集或寡核苷酸引物集组，其中，所述一种或多种基因的部分含有一种或多种突变，所述一种或多种突变赋予对乙胺丁醇、异烟肼、吡嗪酰胺、利福平、链霉素、阿米卡星、贝达喹啉、卷曲霉素、环丙沙星、氯苯吩嗪、乙硫异烟胺、卡那霉素、利奈唑胺、莫西沙星、氧氟沙星和喹诺酮类中的一种或多种抗生素的耐药性，优选地其中，所述一种或多种突变是一种或多种单核苷酸多态性。8.一种多重PCR反应混合物，所述混合物包括寡核苷酸引物集的一个或多个组，所述寡核苷酸引物集用于扩增来自结核分枝杆菌复合群中的结核分枝杆菌和/或相关细菌的一种或多种基因的部分，所述一种或多种基因选自包括以下项的组或由以下项组成的组：eis、embB、ethA、fabG1、gidB、gyrA、inhA、katG、pncA、rrl、rplC、rpoB、rpsL、rrs、rv0678和tlyA中的一种或多种，其中，每个集包括特异于所述部分的一对正向和反向引物，其中，所述寡核苷酸引物集的组包括SEQ ID No.1、2、3、4、5、6、7、8、9和10(表7中的第1组)中的一种或多种；SEQ ID No.11、12、13、14、15、16、17、18、19和20(表7中的第2组)中的一种或多种；和/或SEQ ID No.21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31和32(表7中的第3组)中的一种或多种。9.根据权利要求8所述的多重PCR反应混合物，其包括由以下项组成的寡核苷酸引物集的组：
(a)SEQ ID No.1、2、3、4、5、6、7、8、9和10(表7中的第1组)；(b)SEQ ID No.11、12、13、14、15、16、17、18、19和20(表7中的第2组)；或(c)SEQ ID No.21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31和32(表7中的第3组)。10...

【专利技术属性】
技术研发人员：贾斯汀，
申请(专利权)人：夸德拉姆生物科学研究所，
类型：发明
国别省市：