一种基于CRISPR/cas12a的B族链球菌快速检测体系及方法技术

本发明专利技术提供了一种基于CRISPR/cas12a的B族链球菌快速检测体系及方法。具体地，本发明专利技术提供了一种用于检测GBS核酸分子的检测体系、试剂盒、胶体金检测试剂以及检测方法。由此极大地缩短了GBS的检测时间，避免了由于GBS感染的短暂性和间歇性而带来的漏诊，且本发明专利技术建立的经济便携式的即时检测方法对缺乏医疗设备的基层及偏远地区或是发展中国家GBS的检测具有重要意义，简易的操作使得GBS的家庭自检成为可能。为可能。

【技术实现步骤摘要】
一种基于CRISPR/cas12a的B族链球菌快速检测体系及方法


[0001]本专利技术涉及生物
，更具体涉及一种基于CRISPR/cas12a的B族链球菌快速检测体系及方法。

技术介绍

[0002]感染性疾病因为其高发病率和高死亡率，严重威胁人类生命健康。尤其是传染性强、突变率高的病原体易形成大流行，是对全球公共卫生系统的巨大考验。对感染性疾病进行早期快速准确的诊断是降低其病死率，改善预后，限制传播的关键性举措，也是检验医学研究的重要内容。核酸检测是感染性疾病诊断的重点，与抗原、抗体检测相比，具有更高的灵敏度和特异性，对于早期诊断最为准确可靠。
[0003]B族链球菌(group B streptococcus,GBS)，即无乳链球菌，为革兰氏阳性、触酶阴性的兼性厌氧菌，呈直径小于2μm的球形或卵圆形。60％的女性会间歇性感染GBS且不表征出任何临床症状，感染者中的40％～70％在分娩过程中会传递给新生儿，大约有1％～3％的新生儿会发生早发型(GBS early
‑
onset disease,GBS
‑
EOD)或迟发型(GBS late
‑
onset disease,GBS
‑
LOD)感染，导致败血症、脑膜炎以及肺炎等，其中5％可导致死亡。GBS感染因引起败血症、脑膜炎和肺炎等而成为婴儿致病死亡的主要原因。菌毛、表面蛋白和荚膜多糖与GBS的毒力相关，根据抵抗宿主细胞吞噬的荚膜多糖结构不同，可以将GBS分成10个血清型，即Ia、Ib、II～IX。
[0004]自1938年报道首例致死性产后感染病例到上世纪70年代，GBS成为新生儿败血症和脑膜炎的主要病原体，是产前筛查联合预防性使用抗生素(intrapartum antibiotic prophylaxis,IAP)策略实施之前的发达国家新生儿死亡的头号感染因素。得益于IAP的广泛实施，近年GBS
‑
EOD感染率已显著下降，然而LOD患病率并没有明显变化，并且GBS导致的超迟发型感染(long late onset disease，LLOD)的患病率也没有明显变化，仍是新生儿发病和死亡的主要原因之一。
[0005]因此，本领域迫切需要开发一种便携、快速、敏感的GBS检测方法，对于GBS的早期发现，特别是对缺乏医疗设备的基层及偏远地区或发展中国家GBS的检测以减少其对孕妇和新生儿的危害具有重要的意义。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的就是提供一种基于CRISPR/cas12a的B族链球菌快速检测体系及方法。
[0007]在本专利技术的第一方面，提供了一种用于检测GBS核酸分子的检测体系，所述检测体系包含：
[0008](a)Cas12a蛋白；
[0009](b)向导RNA，所述向导RNA引导Cas12a蛋白特异性结合于GBS核酸分子；和
[0010](c)核酸探针，所述核酸探针为单链DNA；
[0011]其中，所述的GBS核酸分子为DNA分子。
[0012]在另一优选例中，所述的检测包括：定性检测或定量检测。
[0013]在另一优选例中，所述的检测体系还含有(d)缓冲液。
[0014]在另一优选例中，所述的检测体系还含有待检测的GBS核酸分子。
[0015]在另一优选例中，所述的检测体系还含有：
[0016](e1)用于扩增GBS核酸分子的聚合酶；
[0017](e2)任选的用于反转录的反转录酶；
[0018](e3)用于扩增反应和/或反转录反应的dNTP。
[0019]在另一优选例中，所述检测体系为进行核酸扩增反应和旁路切割反应的体系，并且所述的核酸扩增反应和旁路切割反应是同时进行的，所述检测体系为一步法检测体系。
[0020]在另一优选例中，所述的检测体系还含有用于LAMP反应的试剂。
[0021]在另一优选例中，所述的待检测的GBS核酸分子在所述检测体系中的含量为50ng
‑
5000ng；较佳地50ng
‑
1000ng。
[0022]在另一优选例中，所述的待检测的GBS核酸分子在所述检测体系中的浓度为1
‑
100拷贝/微升或1
‑1×
10
15
拷贝/微升，较佳地1
‑
10拷贝/微升，更佳地1
‑
5拷贝/微升。
[0023]在另一优选例中，所述的检测体系中，所述核酸探针与所述GBS核酸分子的摩尔比为20:1至500:1，较佳地50:1至100:1。
[0024]在另一优选例中，所述的向导RNA的长度为30
‑
50nt，较佳地35
‑
45nt，更佳地41nt。
[0025]在另一优选例中，所述的向导RNA的长度为60
‑
100nt，较佳地70
‑
90nt，更佳地82nt。
[0026]在另一优选例中，所述的向导RNA具有选自下组的序列：如SEQ ID NO:7所示的序列、如SEQ ID NO:8所示的序列，或其组合。
[0027]在另一优选例中，所述的向导RNA具有如SEQ ID NO:7所示的序列。
[0028]在另一优选例中，所述的GBS核酸分子包括基于RNA反转录形成的DNA。
[0029]在另一优选例中，所述的GBS核酸分子包括cDNA。
[0030]在另一优选例中，所述的GBS核酸分子选自下组：单链DNA、双链DNA、或其组合。
[0031]在另一优选例中，所述的核酸探针带有荧光基团和淬灭基团。
[0032]在另一优选例中，所述的荧光基团和淬灭基团各自独立地位于所述核酸探针的5
’
端、3
’
端和中部。
[0033]在另一优选例中，所述的核酸探针的长度为3
‑
300nt，较佳地5
‑
100nt，更佳地6
‑
50nt，最佳地8
‑
20nt。
[0034]在另一优选例中，所述的GBS核酸分子包括来源于孕妇、新生儿的GBS核酸分子。
[0035]在另一优选例中，所述的GBS核酸分子是人工合成或天然存在的DNA。
[0036]在另一优选例中，所述的GBS核酸分子包括野生型或突变型的DNA。
[0037]在另一优选例中，所述的GBS核酸分子包括由RNA逆转录或扩增而获得的DNA，如cDNA等。
[0038]在另一优选例中，所述的核酸探针包括带有可检测标记的单链DNA。
[0039]在另一优选例中，所述的单链DNA为荧光和生物素标记的单链DNA。
[0040]在另一优选例中，所述的单链DNA为荧光标记的单链DNA。
[0041]在另一优选例中，所述的单链DNA为在5'端标记荧光基团FAM并在3'端本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于检测GBS核酸分子的检测体系，其特征在于，所述检测体系包含：(a)Cas12a蛋白；(b)向导RNA，所述向导RNA引导Cas12a蛋白特异性结合于GBS核酸分子；和(c)核酸探针，所述核酸探针为单链DNA；其中，所述的GBS核酸分子为DNA分子。2.如权利要求1所述的检测体系，其特征在于，所述检测体系还含有：(e1)用于扩增GBS核酸分子的聚合酶；(e2)任选的用于反转录的反转录酶；(e3)用于扩增反应和/或反转录反应的dNTP。3.如权利要求1所述的检测体系，其特征在于，所述的向导RNA的长度为30
‑
50nt，较佳地35
‑
45nt，更佳地41nt。4.如权利要求1所述的检测体系，其特征在于，所述的向导RNA具有选自下组的序列：如SEQ ID NO:7所示的序列、如SEQ ID NO:8所示的序列，或其组合。5.如权利要求1所述的检测体系，其特征在于，所述的单链DNA为在5'端标记荧光基团FAM并在3'端标记淬灭基团BHQ1后的荧光探针。6.如权利要求1所述的检测体系，其特征在于，所述的核酸探针为在5'端标记FAM并在3'端标记Biotin后的分子探针。7.一种用于检测GBS核酸分子的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：i)第一容器以及位于第一容器内的Cas12a蛋白；ii)任选的第二容器以及位于第二容器内的向导RNA，所述向导RNA引导所述Cas12a蛋白特异性结合于GBS核酸分子；iii)第三容器以及位于第三容器内的核酸探针；iv)任选的第四容器以及位于第四容器内的缓冲液；其中，所述的GBS核酸分子为DNA分子。8.如权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒还含有用于LAMP反应的试剂，其中所述的用于LAMP反应的试剂包括LAMP引物，并且所述LAMP引物具有选自下组的序列：如SEQ ...

【专利技术属性】
技术研发人员：张传领，蒋国军，徐洁颖，陈云，应晓波，
申请(专利权)人：浙江萧山医院，
类型：发明
国别省市：