一种RPA-Cas12a一锅法检测系统及其应用技术方案

本发明专利技术公开了一种RPA

【技术实现步骤摘要】
一种RPA
‑
Cas12a一锅法检测系统及其应用


[0001]本专利技术属于重要水产病害现场快检，具体涉及一种RPA
‑
Cas12a一锅法检测系统及其应用。

技术介绍

[0002]急性肝胰腺坏死病(Acute hepatopancreatic necrosis disease,AHPND)是对虾养殖中最严重的传染病之一。该疾病起病快、传染性强、死亡率高，已给养殖业造成巨大的经济损失。由于目前还没有有效的治疗方法，早期诊断是降低经济损失的根本方法。AHPND的传统诊断方法包括疾病相关症状分析和组织病理学特征分析。这些方法通常是费力的，耗时的，而且诊断结果不明确，需要依赖专业的操作人员。现代分子技术的应用使AHPND的诊断只需几个小时即可完成，极大地提高了检测效率。这些分子诊断方法都基于PCR，包括PCR、qPCR和巢式PCR，其中巢式PCR是AHPND分子诊断的金标准。然而这些基于PCR的分析不能满足即时检测(Point
‑
of
‑
care testing，POCT)的需求，因为它们需要依赖实验室的热循环设备，往往不能满足现场检测需求。随着技术的不断发展，等温扩增技术应运而生，基于环介导等温扩增(LAMP)和重组酶聚合酶扩增(Recombinase polymerase amplification,RPA)等已成功应用于AHPND诊断，具有POCT目的。然而，由于发展年限尚浅，当前的等温扩增技术并没有PCR技术稳定，容易受到环境中多种因素的干扰。如LAMP反应条件等温，扩增效率高，但假阳性信号概率高；与LAMP相比，RPA具有更方便的等温条件(25
‑
42
°
C)，与荧光探针或横向流动试纸(LFD)结合时，可轻松应用于POCT，然而，基于RPA的侧向流试纸条法和荧光法都需要使用昂贵的特异性探针，检测成本高，反应信号来源于探针的切割，体系复杂，不稳定。将等温扩增技术与CRISPR系统结合是解决这种困难的良好方法。在等温扩增步骤的基础上增加一步CRISPR
‑
Cas蛋白的识别步骤，可以提高检测的准确性和灵敏度。基于此原理，将RPA技术与CRISPR
‑
Cas12a系统组合，已成功开发了DETECTR检测技术，且该技术已广泛应用于多种检测方法的开发。基于DETECTR的检测方法准确可靠，现有技术中公开了一种RPA
‑
Cas12a检测系统(中国申请号2022108198227)，然而，这种RPA扩增与CRISPR切割步骤分开的两步法需要扩增子转移步骤，操作不太便利，转移步骤有污染的风险。因此开发更便捷的RPA
‑
CRISPR一锅法快速检测虾急性肝胰腺坏死病具有重要意义。

技术实现思路

[0003]专利技术目的：针对现有检测技术将RPA与CRISPR/Cas12a联合用于AHPND诊断的两步法操作不适用于POCT且存在污染的风险，本专利技术提供了一种RPA
‑
Cas12a一锅法检测系统，本专利技术利用基于次优原间隔相邻基元(suboptimal protospacer adjacent motifs，sPAM)设计的特殊crRNA并首次运用于肝胰腺坏死病系统，成功开发了一种RPA
‑
CRISPR一锅法检测系统，将RPA扩增和CRISPR/Cas12a切割整合到同步反应中，克服了RPA扩增和Cas12a切割在一个反应管中的不兼容性问题(图1)。整个检测过程，只需要一次加样步骤，避免了扩增子转移过程中潜在的污染问题，简化了操作步骤，同时检测灵敏度显著提高。本专利技术为具有
POCT目的AHPND诊断提供了新的选择，为开发RPA
‑
CRISPR一锅分子诊断方法提供了良好的借鉴。
[0004]本专利技术还提供了RPA
‑
Cas12a一锅法检测系统在重要水产养殖传染病肝胰腺坏死病的快速现场检测中的应用。
[0005]技术方案：为了实现上述目的，本专利技术所述一种RPA
‑
Cas12a一锅法检测系统，包括RPA预混液和CRISPR
‑
Cas12a预混液；所述RPA预混液包括用于扩增RPA产物的正向引物RPA
‑
F和反向引物RPA
‑
R；所述CRISPR
‑
Cas12a预混液包括ssDNA、Cas12a和crRNA；所述ssDNA为两端分别修饰有荧光基团FAM和猝灭基团BHQ1的单链DNA；crRNA为基于次优PAM序列设计的能引导Cas12a靶向识别AHPND RPA产物的特异性向导RNA序列。
[0006]其中，所述RPA
‑
F的序列为CATCTTTGACGGAATTTAACCCTAACAAT；所述RPA
‑
R的序列为TAACTAAACCAATGTAATCATCTTTTGC。
[0007]其中，所述ssDNA的序列为5
’
FAM
‑
TTATT
‑3’
BHQ1。
[0008]其中，所述crRNA序列优选为UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUAUUAAUGUCUUGAAUUUUAUC。
[0009]作为优选，所述RPA预混液中还包括RPA Buffer A和DEPC水；所述RPA
‑
Cas12a一锅法检测系统中还包括RPA Buffer B。其中，所述RPA buffer A和RPA Buffe B均为是RPA试剂盒里的组分，所述RPA buffer A提供的是RPA反应的缓冲条件；RPA buffer B为醋酸镁，用于启动RPA反应开始。
[0010]作为优选，所述CRISPR
‑
Cas12a预混液包括LbCas12a、10X NEB Buffer 2.1、crRNA和荧光分子ssDNA
‑
FQ。
[0011]进一步地，CRISPR
‑
Cas12a预混液包括0.5μl LbCas12a(1μM)、0.5μl 10X NEB Buffer 2.1、0.5μl crRNA(1.2μM)和0.4μl的荧光分子ssDNA
‑
FQ(10μM)。
[0012]本专利技术所述的RPA
‑
Cas12a一锅法检测系统在重要水产养殖传染病肝胰腺坏死病的快速现场检测中的应用。
[0013]其中，所述快速现场检测的方法为：将RPA预混液、Cas12a预混液和模板DNA加入RPA Buffer B混合在实时荧光定量PCR仪中进行一锅反应，进行荧光定量PCR反应过程中采集FAM荧光信号，终点信号在紫外线下可见，并拍摄图像。
[0014]其中，所述模板DNA为含或者不含AHPND毒力基因pirB上一段区别于其他物种的保守序列的模板DNA。
[0015]当检测样品为阳性时，所述RP本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种RPA
‑
Cas12a一锅法检测系统，其特征在于，包括RPA预混液和CRISPR
‑
Cas12a预混液；所述RPA预混液包括用于扩增RPA产物的正向引物RPA
‑
F和反向引物RPA
‑
R；所述CRISPR
‑
Cas12a预混液包括ssDNA、Cas12a和crRNA；所述ssDNA为两端分别修饰有荧光基团FAM和猝灭基团BHQ1的单链DNA；crRNA为基于次优PAM序列设计的能引导Cas12a靶向识别AHPND RPA产物的特异性向导RNA序列。2.根据权利要求1所述的RPA
‑
Cas12a一锅法检测系统，其特征在于，所述RPA
‑
F的序列为CATCTTTGACGGAATTTAACCCTAACAAT；所述RPA
‑
R的序列为TAACTAAACCAATGTAATCATCTTTTGC。3.根据权利要求1所述的RPA
‑
Cas12a一锅法检测系统，其特征在于，所述ssDNA的序列为5
’
FAM
‑
TTATT
‑3’
BHQ1。4.根据权利要求1所述的RPA
‑
Cas12a一锅法检测系统，其特征在于，所述crRNA序列优选为UAAUUUCUACUAAGUGUAGA...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄和，王佩，杨莎，林蕾，张幸，李昺之，
申请(专利权)人：南京师范大学，
类型：发明
国别省市：