【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于测序，涉及一种制备靶向测序文库方法及其应用，尤其涉及一种防污染靶向测序文库制备方法及其应用。
技术介绍
1、第二代测序(next-generation sequencing，ngs)又称为高通量测序(high-throughput sequencing)，是近年来蓬勃发展的一项新兴技术，可以一次检测几十兆，数百兆甚至更多的核酸分子的序列。基于高通量测序的靶向测序技术(tngs)是将多重pcr或探针富集的原理与高通量测序相结合的新的检测技术，其针对性更强，检测费用低、检测速度快、检测灵敏度高等特点，相对于目前常用的分子检测的技术(如多重pcr)具有检测范围广，精度高的特点，在微生物检测，遗传病辅助诊断，肿瘤精准检测等多个领域均具有重要的地位。
2、以多重pcr为核心的靶向测序技术，是以多重pcr的方式进行靶向测序文库的制备并测序的一种技术。经典方式为：通过第一轮pcr扩增目标区域，随后使用第二轮pcr进行接头连接，获得靶向测序文库用于测序；而随着技术发展，新的一步扩增构建靶向测序文库的方法逐渐产生，其不仅能够将建库流程简单化，同时也可以防止两步法过程中的样本间相互污染的问题，如cn105525357a公开了一种测序文库的构建方法及试剂盒和应用，将靶dna与转座酶包埋复合物在转座反应的条件下孵育，产生两端带有双接头的dna文库。
3、然而，一步扩增建库的方法依旧无法解决不同批次间的污染累积问题，即单次试验过程中逸散的气溶胶残留在环境中作为下一次实验的污染源，产生假阳性；亦无法监控污染来源。>
4、综上所述，开发新型的测序文库的构建方法，有效防止及监控污染，对于靶向测序领域具有重要意义。
技术实现思路
1、针对现有技术的不足和实际需求，本专利技术提供一种制备靶向测序文库方法及其应用，尤其涉及一种防污染靶向测序文库制备方法及其应用。
2、为达上述目的，本专利技术采用以下技术方案：
3、第一方面，本专利技术提供一种制备靶向测序文库方法，所述方法包括：
4、将靶标dna与建库混合物混合，获得pcr体系，进行pcr扩增，得到所述靶向测序文库；所述建库混合物包括扩增引物、接头引物、udg酶、dntps和pcr酶；所述扩增引物与靶标dna互补配对，包括上游引物和下游引物，所述上游引物和下游引物中至少一个的5’端含有umi特异性标签，所述umi特异性标签为随机序列。
5、本专利技术中，开发防污染靶向测序文库制备方法，在pcr反应体系中加入udg酶，使用特定温度激活udg酶并发挥作用，降解在配置过程中可能引入的气溶胶污染，在扩增引物上设计不同的umi序列标签，以双重标签达到防止及监控污染的作用，能够避免气溶胶引起的实验污染，并监控可能的污染来源，为靶向测序的应用提供更为广阔的市场价值。
6、优选地，所述umi特异性标签长度为6～10bp，包括但不限于7bp、8bp或9bp。
7、优选地，所述接头引物包括正向引物和反向引物，所述正向引物从5’到3’端包括p5接头序列和第一标签序列，所述反向引物从5’到3’端包括p7接头序列和第二标签序列。
8、优选地，所述上游引物和下游引物的5’端还含有公共序列。
9、优选地，所述正向引物和反向引物的3’端还含有公共序列。
10、优选地，所述公共序列的长度为15～22bp，包括但不限于16bp、17bp、18bp、19bp、20bp或21bp。
11、优选地，所述建库混合物还包括封闭引物，所述封闭引物包括所述公共序列的反向互补序列或部分反向互补序列。
12、优选地，所述封闭引物在3’末端具有封闭修饰，无法进行延伸。
13、本专利技术进一步引入公共序列和封闭引物，降低接头引物和扩增引物所产生的引物二聚体，能够在一个反应管中实现文库的一步制备，显著减少操作步骤，提高文库制备效率，提升用户友好性。
14、优选地，所述建库混合物还包括pcr缓冲液。
15、优选地，所述公共序列的核酸序列包括seq id no.1所示的序列。
16、优选地，所述封闭引物的核酸序列包括seq id no.2所示的序列。
17、seq id no.1：gactgccgctggttggatg。
18、seq id no.2：catccaaccagcggcagtc。
19、优选地，所述第一标签序列包括特异性序列标签i5。
20、优选地，所述第二标签序列包括特异性序列标签i7。
21、本专利技术进行深入研究，开发防污染靶向测序文库制备方法，在一步反应同时完成目标区域扩增和含有特异性标签的文库构建的基础上，在pcr反应体系中加入udg酶及umi序列标签，可在一个反应管中实现靶向测序文库的一步pcr建库，减少操作步骤，提升用户友好性，同时，也避免气溶胶引起的实验污染，并监控可能的污染来源。
22、优选地，所述pcr体系中引物的总浓度为4pmol/μl～12pmol/μl，包括但不限于5pmol/μl、6pmol/μl、7pmol/μl、8pmol/μl、9pmol/μl、10pmol/μl或11pmol/μl。
23、优选地，所述pcr酶包括taq dna聚合酶。
24、优选地，所述pcr体系中pcr酶的浓度为5u/反应～10u/反应，包括但不限于6u/反应、7u/反应、8u/反应或9u/反应。
25、优选地，所述pcr体系中dntps总浓度为1mm～5mm，包括但不限于1.5mm、2mm、2.5mm、3mm、3.5mm、4mm、4.5mm或4.8mm。
26、优选地，所述pcr体系中udg酶浓度为0.05u/反应～0.5u/反应，例如可以是0.06u/反应、0.08u/反应、0.09u/反应、0.1u/反应、0.2u/反应、0.3u/反应、0.4u/反应、0.45u/反应或0.48u/反应。
27、优选地，所述pcr扩增的程序包括：
28、udg酶孵育：25～37℃，5～20min。
29、udg酶失活及热裂解：93～94℃，3～15min。
30、pcr循环反应：93～95℃，10～50s；50～70℃，0.5～2min；50～70℃，0.5～2min；20～50个循环。
31、第二方面，本专利技术提供一种用于制备靶向测序文库试剂盒，所述试剂盒包括第一方面所述制备靶向测序文库方法中的扩增引物和接头引物。
32、优选地，所述上游引物从5’到3’端依次包括公共序列和靶标dna目标区域上游的互补序列，所述下游引物从5’到3’端依次包括公共序列和靶标dna目标区域下游的互补序列，所述上游引物或下游引物中至少一个在公共序列和互补序列之间还含有umi特异性标签。
33、优选地，所述接头引物包括正向引物和反向引物，所述正向引物从5’到3’端包括p5接头序列、本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种制备靶向测序文库方法，其特征在于，所述方法包括：
2.根据权利要求1所述的制备靶向测序文库方法，其特征在于，所述UMI特异性标签长度为6～10bp。
3.根据权利要求1或2所述的制备靶向测序文库方法，其特征在于，所述接头引物包括正向引物和反向引物，所述正向引物从5’到3’端包括P5接头序列和第一标签序列，所述反向引物从5’到3’端包括P7接头序列和第二标签序列。
4.根据权利要求3所述的制备靶向测序文库方法，其特征在于，所述上游引物和下游引物的5’端还含有公共序列；
5.根据权利要求4所述的制备靶向测序文库方法，其特征在于，所述公共序列的核酸序列包括SEQ ID NO.1所示的序列；
6.根据权利要求1-5任一项所述的制备靶向测序文库方法，其特征在于，所述PCR体系中引物的总浓度为4pmol/μL～12pmol/μL；
7.根据权利要求1-6任一项所述的制备靶向测序文库方法，其特征在于，所述PCR扩增的程序包括：
8.一种用于制备靶向测序文库试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述
9.根据权利要求8所述的用于制备靶向测序文库试剂盒，其特征在于，所述上游引物从5’到3’端依次包括公共序列和靶标DNA目标区域上游的互补序列，所述下游引物从5’到3’端依次包括公共序列和靶标DNA目标区域下游的互补序列，所述上游引物或下游引物中至少一个在公共序列和互补序列之间还含有UMI特异性标签；
10.权利要求1-7任一项所述的制备靶向测序文库方法或权利要求8或9所述的用于制备靶向测序文库试剂盒在靶向测序中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种制备靶向测序文库方法，其特征在于，所述方法包括：
2.根据权利要求1所述的制备靶向测序文库方法，其特征在于，所述umi特异性标签长度为6～10bp。
3.根据权利要求1或2所述的制备靶向测序文库方法，其特征在于，所述接头引物包括正向引物和反向引物，所述正向引物从5’到3’端包括p5接头序列和第一标签序列，所述反向引物从5’到3’端包括p7接头序列和第二标签序列。
4.根据权利要求3所述的制备靶向测序文库方法，其特征在于，所述上游引物和下游引物的5’端还含有公共序列；
5.根据权利要求4所述的制备靶向测序文库方法，其特征在于，所述公共序列的核酸序列包括seq id no.1所示的序列；
6.根据权利要求1-5任一项所述的制备靶向测序文库方法，其特征在于，所述pcr体系中...
【专利技术属性】
技术研发人员：王杨，吴春求，朱鹏远，邹树勇，陈嘉昌，柳俊，胡朝晖，
申请(专利权)人：广州市金圻睿生物科技有限责任公司，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。