【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及重组蛋白纯化领域，具体涉及重组蛋白的快速分离纯化方法。
技术介绍
1、基因工程大规模发酵培养生产蛋白质药物已经成为当今大分子生物制药领域的主流，重组蛋白类药物目前普遍的使用大肠杆菌、酵母、中国仓鼠卵巢(cho)、293细胞等进行表达，伴随着目标蛋白质的表达的过程，大量的相关杂质也跟随产生，例如宿主细胞蛋白质(host cell protein，hcp)和宿主dna(host cell dna，hcd)，对于临床的蛋白药物来讲，hcp和hcd是最大的两类污染物，会影响蛋白药物的纯度、稳定性、成药性和药效，甚至会引起机体不良的过敏反应。因此，在蛋白纯化过程中如何快速有效地去除hcp和hcd是蛋白下游工艺开发的重要组成部分。
2、目前重组蛋白的下游分离纯化方法主要有亲和层析、分子筛、阴阳离子交换、疏水层析、羟基磷灰石吸附层析以及硫酸铵沉淀法、蛋白质等电点沉淀法等方法。现有重组蛋白纯化工艺往往是上面两种或两种以上方法的组合对重组蛋白进行纯化，工艺繁琐，需要设备和填料等耗材昂贵，对操作条件要求也比较苛刻、耗时大、成本高，而且分离过程中容易发生蛋白变性等，降低了纯化的效率，实现规模化工业生产仍需要较大的投入。
3、许多非色谱方法已经被选择来取代蛋白质色谱，比如膜吸附、沉淀、磁分离、结晶、以及双水相萃取。在这些方法中，双水相萃取方法有潜力成为一种高通量、低成本的替代蛋白质色谱的方法。
4、双水相系统是一种提供细胞、细胞膜、病毒、蛋白质、核酸和其他生物分子的安全分离和纯化的新技术。由两相互不相溶
5、离子液体双水相是2003年发现的一种新的双水相分离纯化技术。离子液体(ils)是一种室温熔融盐，具有稳定性高、粘度低、电导率高等优良性能，近年来被广泛应用于电化学、生物催化转换、生物活性物质的萃取分离领域等。离子液体的挥发性可忽略及可通过改变阴阳离子的组装很好地调节离子液体的特性，这种“可调节性”使得离子液体这种独特的化合物可以被设计成满足特定过程的精确条件，操纵它们对特定生物分子的提取能力。
6、双水相应用于蛋白分离纯化有着条件温和、规模易放大的优势，然而双水相一般易被体系ph值、温度、聚合物、盐浓度等影响成相。目前针对大肠杆菌表达的重组蛋白纯化的双水相系统成分相对复杂，且获得的产物蛋白纯度等有必要进一步提高。本专利技术双水相条件下ph值、温度、中性盐浓度均不影响重组人乙醇脱氢酶的分离纯化，无需昂贵的设备，操作过程快速简单，适合实验室小量纯化的同时也能满足工业化生产需求。
技术实现思路
1、有鉴于此，本专利技术要解决的技术问题在于提供一种重组蛋白的快速分离纯化方法。
2、本专利技术提供了溶液组合，其包括双水相萃取液、蛋白变性液和蛋白复性液；
3、所述双水相萃取液包括10％～20％(w/w)peg400、10％～20％(w/w)na2so4和1％～5％(w/w)[n2222]br；
4、所述蛋白变性液包括5m～7m尿素、8mm～12mm tris、0.2m～0.4m nacl、9mm～11mm咪唑；
5、所述蛋白复性液包括0.5m～1.5m尿素、8％～12％(w/v)蔗糖、18mm～22mm tris、0.1m～0.3m nacl、0.1mm～0.3mm gsh、0.05mm～0.15mm gssg。
6、进一步的，
7、所述双水相萃取液包括12％(w/w)peg400、14％(w/w)ph为4～9的na2so4，2％(w/w)[n2222]br。
8、所述蛋白变性液包括6m尿素、10mm tris、0.3m nacl、10mm咪唑，ph 8.0
9、所述蛋白复性液包括1m尿素、10％(w/v)蔗糖、20mm tris、0.2m nacl、0.2mm gsh、0.1mm gssg，ph 8.0。
10、本专利技术的具体实施例中，对大肠杆菌基因工程菌中的人乙醇脱氢酶进行了提取和纯化。所述人乙醇脱氢酶在大肠杆菌中诱导表达后，经菌体收集，重悬和破碎等步骤获得含有所述人乙醇脱氢酶的包涵体，包涵体经变性和复性获得所述人乙醇脱氢酶复性蛋白溶液，所述复性蛋白溶液经本专利技术的双水相萃取液萃取，在中层样品中，可获得回收率97.71％，纯度达到96.27％。
11、本专利技术对重组蛋白萃取前的步骤和试剂进行了优化，实验结果表明，以本专利技术所述完成重组蛋白的变性和复性后，进一步经萃取，获得的重组蛋白纯度最好。
12、进一步的，本专利技术对所述双水相液的成分配比进行了优化，实验结果表明，与其他配比相比，所述双水相萃取液的组成为12％(w/w)peg400、14％(w/w)na2so4 14％和2％(w/w)[n2222]br时的萃取效果最好。
13、本专利技术提供了大肠杆菌重组蛋白的提取纯化方法，其包括利用本专利技术所述的溶液组合对重组蛋白进行提取。
14、进一步的，
15、所述重组蛋白为人乙醇脱氢酶；
16、所述大肠杆菌为大肠杆菌bl21。
17、更进一步的，所述的提取纯化方法包括如下步骤：
18、步骤1、重组蛋白在大肠杆菌中诱导表达后经菌体收集、重悬、菌体破碎、包涵体溶解和复性后获得重组蛋白复性溶液；
19、步骤2、所述重组蛋白复性溶液与双水相萃取液混合后经静置、离心分层，在中间相获得重组蛋白溶液；
20、所述包涵体溶解的溶液为蛋白变性液；
21、所述复性的溶液为蛋白复性液。
22、在所述的提取纯化方法中，
23、所述重组蛋白复性溶液与双水相萃取液的质量比为0.55/3；
24、所述重组蛋白复性溶液中重组蛋白的浓度为400μg/ml。
25、所述菌体收集的条件为5000rpm，5min；
26、所述重悬的溶液为pbs；
27、所述菌体破碎利用超声破碎，所述超声破碎的条件为工作3s，间隔3s，持续20min。
28、所述混合的温度为15℃～40℃；
29、所述静置的时间为1～2min；
30、所述离心分层的条件为2000rpm，5min。
31、本专利技术提供了所述的提取纯化方法纯化获得的重组蛋白。
32、本专利技术所述双水相对重组人乙醇脱氢酶的快速分离纯化方法与现有技术相比有以下优势：
33、本专利技术对大肠杆菌中的重组人乙醇脱氢酶进行了提取和纯化，与现有技术相比，本专利技术所述的提取纯化工艺简单，成本低，溶剂回收容易，流程耗时短，1～2min体系就可以分相，且只需一步双水相即可达到纯化目的，可在15～30min之内快速本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.溶液组合，其特征在于，包括双水相萃取液、蛋白变性液和蛋白复性液；
2.根据权利要求1所述的溶液组合，其特征在于，
3.大肠杆菌重组蛋白的提取纯化方法，其特征在于，包括利用如权利要求1或2所述的溶液组合对重组蛋白进行提取。
4.根据权利要求3所述的提取纯化方法，其特征在于，
5.根据权利要求3或4所述的提取纯化方法，其特征在于，包括如下步骤：
6.根据权利要求5所述的提取纯化方法，其特征在于，
7.根据权利要求5所述的提取纯化方法，其特征在于，
8.根据权利要求5所述的提取纯化方法，其特征在于，
9.权利要求3～8任一项所述的提取纯化方法纯化获得的重组蛋白。
【技术特征摘要】
1.溶液组合，其特征在于，包括双水相萃取液、蛋白变性液和蛋白复性液；
2.根据权利要求1所述的溶液组合，其特征在于，
3.大肠杆菌重组蛋白的提取纯化方法，其特征在于，包括利用如权利要求1或2所述的溶液组合对重组蛋白进行提取。
4.根据权利要求3所述的提取纯化方法，其特征在于，
5.根...
【专利技术属性】
技术研发人员：汪洋，高甜甜，
申请(专利权)人：浙江华缔药业集团医药开发有限公司，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。