序列的应用、重组载体及其提高PVX植物表达载体蛋白表达量的方法技术

本发明专利技术涉及植物生产重组蛋白领域，特别涉及序列的应用、重组载体及其提高PVX植物表达载体蛋白表达量的方法。发现CP基因3`端至少50bP的序列对提高目的基因的表达有明显的作用，序列详见表1。在目的基因开放阅读框后保留CP基因3`端50bp的序列，能显著提高目的基因的表达。

【技术实现步骤摘要】
序列的应用、重组载体及其提高PVX植物表达载体蛋白表达量的方法
本专利技术涉及植物生产重组蛋白领域，特别涉及序列的应用、重组载体及其提高PVX植物表达载体蛋白表达量的方法。
技术介绍
随着生物医药技术和产业的不断发展，预计生物制品市场份额将从2016年的25％(2020亿美元)上升到2022年的30％(3620亿美元)。重组蛋白表达式生物制品生产的一个重要组成部分，通过不同的表达平台将目标蛋白大量、稳定的表达并具有相应的生物学功能，最终应用于临床或其他领域。目前，常见蛋白表达平台包括：大肠杆菌、酿酒酵母、杆状病毒/昆虫细胞、哺乳动物细胞等，不同表达平台有各自的优点和缺点。当前，绝大多数生物制药的表达平台是哺乳动物细胞和酵母。但哺乳动物细胞表达成本高，表达量相对较低；酵母表达蛋白折叠和修饰有一定的限制，需要寻求其他新型的表达系统以更便宜、更大量得表达合适修饰和折叠的重组蛋白。植物是一种光合自养生物，其生长培育成本低、易于大规模培养、基因操作简单、蛋白质在植物体内能正确的折叠且不含对人类有害的病毒，是一种非常有潜力的蛋白表达平台。目前，植物蛋白表达平台主要包括转基因植物稳定表达和植物瞬时表达两种。转基因植物生长周期长且受到国家法规的严格控制，大大限制了其在蛋白表达中的应用。随着科学的发展和技术的进步，植物瞬时蛋白表达平台在蛋白表达中的应用越来越广。植物瞬时表达将目标蛋白表达框插入到T-DNA中，借助农杆菌将T-DNA导入植物细胞中表达，从机理上可以分为：病毒型(virus-basedvector)和非病毒型(non-virus-basedvector)。病毒型瞬时表达利用植物病毒在植物细胞快速增殖的特征，可以大大提高目标蛋白的表达和积累。目前，烟草花叶病毒(TobaccoMosaicVirus,TMV)、马铃薯X病毒(PotatoVirusX，PVX)和菜豆黄矮病毒(BeanYellowandDwarfVirus，BeYDV)等病毒被改造用于植物的瞬时表达用于重组蛋白的表达和生产。PVX是一种单链正义RNA病毒，基因组约6.4kb。病毒基因组包含5个开放表达框，编码5个蛋白：ORF1编码RNA依赖的RNA聚合酶(RNA-dependentRNAPolymerase，RDRP)，三个重叠开放阅读框(ORF2、PRF3&ORF4)组成的移动蛋白(MovementProtein，MP)和ORF5编码的外壳蛋白(CoatProtein，CP)(图1)(Hull,2002)。PVX载体相关原件被改造用于植物外源基因的表达，现阶段一般作法是使用花椰菜花叶病毒35S启动子驱动PVX病毒RDRP的表达，保留PVX病毒亚基因组启动子(subgenomicpromoter)用于驱动目的基因的表达，目的基因后连接终止子(Mardanovaetal.,2017)。另外有其他研究表明PVX病毒CP蛋白对PVX载体的稳定性有重要作用(Chapman,Kavanagh,&Baulcombe,1992)。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术针对当前PVX植物表达载体进行改进，发现添加一些序列能够显著提高目的基因的表达，提高重组蛋白的产量。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：本专利技术提供了CP基因的3`端至少50bP的序列在促进PVX植物表达载体中外源目的基因的表达的应用。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述序列如SEQIDNo.1～3中任一项所示。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述外源目的基因包括GFP基因。此外，本专利技术还提供了CP基因的3`端至少50bP的序列在提高PVX植物表达载体中蛋白表达量的应用。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述序列如SEQIDNo.1～3中任一项所示。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述蛋白包括GFP。在上述研究的基础上，本专利技术还提供了重组载体，包括PVX植物表达载体、外源目的基因以及CP基因的3`端至少50bP的序列。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述序列如SEQIDNo.1～3中任一项所示。本专利技术还提供了所述的重组载体在提高外源目的基因的表达或蛋白表达量中的应用。本专利技术海提改娥提高PVX植物表达载体蛋白表达量的方法，构建如权利要求7或8所述的重组载体，转染农杆菌，培养，提取蛋白。本专利技术研究了CP蛋白序列对PVX载体外源目的基因表达的作用，最终发现CP基因3`端至少50bP的序列对提高目的基因的表达有明显的作用，序列详见表1。在目的基因开放阅读框后保留CP基因3`端50bp的序列，能显著提高目的基因的表达。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。图1示PVX基因结构示意图；图2示文献中PVX表达载体；图3示本专利技术中构建PVX载体；图4示不同PVX载体GFP表达情况对比；图5示不同载体GFP表达Western-blot检测。具体实施方式本专利技术公开了序列的应用、重组载体及其提高PVX植物表达载体蛋白表达量的方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本专利技术。本专利技术的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
技术实现思路
、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本专利技术技术。本专利技术以GFP为目标蛋白验证CP蛋白序列对PVX载体的蛋白表达量的作用。首先，根据实验设计构建表达载体(图3)，PVX-ori参照上述文献构建，PVX-CP200在GFP终止密码子后添加CP基因3`端200bp的序列(表1CP-200)，PVX-CP100在GFP终止密码子后添加CP基因3`端100bp的序列(表1CP100)，PVX-CP50在GFP终止密码子后添加CP基因3`端50bp的序列(表1CP50)。PVXCP基因序列参照NCBI登陆号MK387315.1，AF528555.1，EU031437.1,MK587458.1等序列。农杆菌双元载体使用pCambia1300，后续将各载体转入农杆菌GV3101中。培养农杆菌，并使用注射器进行烟草瞬时转化。注射后5天，观察GFP荧光并提取烟草蛋白质进行Western-blot分析。结果如图4和5及表2所示，在目标基因后添加CP蛋白能著提高GFP的表达，PVX-CP200、PVX-CP100和PVX-CP50载体GFP表达量是PVX-ori的3倍以上，差异极显著(p<0.01)，而PVX-CP200、PVX-CP100和PVX-CP50载体GFP之间GFP表达无明显差异。在当前PVX植物表达载体研究基础上，本专利技术发现了一种能够明显提高PVX载体蛋白表达的方法。此专利技术涉及添加PVX病毒一段CP序列到目标基因后，在不影响其他操作的基础上，大大提高了重组蛋白的表达量，降低植本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.CP基因的3`端至少50bP的序列在促进PVX植物表达载体中外源目的基因的表达的应用。/n

【技术特征摘要】
1.CP基因的3`端至少50bP的序列在促进PVX植物表达载体中外源目的基因的表达的应用。


2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述序列如SEQIDNo.1～3中任一项所示。


3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述外源目的基因包括GFP基因。


4.CP基因的3`端至少50bP的序列在提高PVX植物表达载体中蛋白表达量的应用。


5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述序列如SEQIDNo.1～3中任一项所示。


6.如权...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵启超，周昕，郑蔚，濮云飞，翟璐，沈陈超，
申请(专利权)人：浙江华缔药业集团医药开发有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33