双水相体系分离纯化流感病毒样颗粒的方法技术

本发明专利技术涉及病毒样颗粒分离纯化技术领域，具体涉及双水相体系分离纯化流感病毒样颗粒的方法。本发明专利技术提供的双水相体系分离纯化流感病毒样颗粒的方法，采用磷酸缓冲液作为成相盐与PEG400组成双水相萃取体系，对流感病毒样颗粒进行萃取。与现有技术相比，本发明专利技术所述流感病毒样颗粒分离纯化制备方法工艺简单，整个过程仅需静置和离心即可形成双水相，上、下相液体均可回收处理后重复使用，成本低，对环境友好，提取的流感病毒样颗粒的纯度好，流感病毒样颗粒的结构和活性均得到保持，同时提取样本可按比例放大，适用于规模化工业生产推广使用。用。

【技术实现步骤摘要】
双水相体系分离纯化流感病毒样颗粒的方法


[0001]本专利技术涉及病毒样颗粒分离纯化
，具体涉及双水相体系分离纯化流感病毒样颗粒的方法。

技术介绍

[0002]病毒样颗粒(Virus
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like Particles,VLPs)是由某种病毒的一个或多个结构蛋白自组装而成，具有高度结构化的空心蛋白颗粒，其大小从几纳米到数百纳米不等，可在多种不同的细胞类型中通过病毒包膜或衣壳蛋白的表达产生。首先VLPs很容易在昆虫、哺乳动物或植物细胞中表达，并可通过设计携带多种外源性免疫抗原和佐剂。其次，绝大多数VLPs粒径分布于20
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100nm之间，这使得其可以自由进入淋巴管和被动运输至淋巴结包膜下区域，并被抗原提呈细胞(Antigen
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Presenting Cells,APCs)高效摄取。第三，VLPs的形成模仿了病毒的天然装配过程，因而具有与天然病毒粒子相似的结构和结构特征及免疫原性，可激活树突状细胞(Dendritic Cells,DCs)等APCs，将其提呈给T细胞及B细胞，能有效激发更强的体液免疫、细胞免疫和黏膜免疫反应，是一种非常优秀的疫苗抗原递送系统。在VLPs颗粒上分布的重复且高度有序的外源性表位则可以与B细胞受体进行多重结合，进而激发强的B细胞免疫和持久的抗体反应。第四，由于其缺乏调节蛋白和感染性核酸，无复制和感染能力且不依赖于鸡胚培养系统，因而具有很高的安全性。VLPs不能在受体中复制，但由于其重复结构，通过识别重复亚基刺激免疫系统，产生较高的细胞和体液免疫应答反应，这为该类疫苗的制造和施用带来很大方便。基于上述特点，VLPs是一种非常理想的疫苗开发平台，目前己被广泛用于疫苗的研究中，包括流感VLP疫苗。
[0003]流感病毒属于正粘科，可分为四种类型(A，B，C和D)。A型流感病毒和B型流感病毒可引起季节性流行病，C型流感病毒通常引起轻度疾病，D型流感病毒为新出现的流感病毒，可感染牛和猪。流感病毒是包含单链，分节段RNA基因组的包膜颗粒。流感病毒样颗粒(VLPs)是由流感病毒结构蛋白组成的中空结构，其自发组装而产生具有与天然流感病毒相似形态和抗原性的颗粒。VLPs是基因组缺陷结构，因此不能感染细胞。可以使用与用于产生完整病毒的类似方法去生成VLPs。与流感病毒的裂解或亚单位疫苗不同，VLPs具有与天然病毒非常相似的表面抗原呈递的特点。
[0004]流感病毒的下游处理通常包括离心澄清、超滤浓缩、柱层析和超速离心纯化。此外，还有使用蔗糖、酒石酸钾、和氯化铯进行密度梯度离心或连续流离心从培养液中纯化病毒的方法。
[0005]现有流感VLP技术存在的问题及缺陷为：
[0006](1)超滤浓缩技术虽然抗原回收率很高，在提高病毒或病毒样颗粒含量的同时，宿主蛋白也被成倍提高，对抗原来说浓缩作用大于纯化用，且同时需要专业的设备。故只能用于纯化的初级阶段来减小抗原溶液的体积；
[0007](2)柱层析技术在蛋白纯化下游工艺为成熟的技术，但是纯化病毒或者病毒样颗粒需要特定的填料，填料成本太高，且也需要配套的层析设备，价格高昂；(3)密度梯度离心
或连续流离心纯化病毒或病毒样颗粒，不仅操作繁琐，需要相应的超高速离心机或者连续流离心机，设备成本高且不利于大规模纯化。
[0008]因此，开发出简单实用、价格低廉且易于操作的病毒样颗粒快速纯化方法，是目前亟待解决的技术问题。

技术实现思路

[0009]有鉴于此，本专利技术要解决的技术问题在于提供双水相体系分离纯化流感病毒样颗粒的方法，本专利技术提供了操作简单、实用、价格低廉且提取纯度高的双水相体系分离纯化流感病毒样颗粒的方法。
[0010]本专利技术提供了双水相成相剂组合物，由磷酸缓冲液与PEG400溶液组成，其中，所述磷酸缓冲液由水、KH2PO4和K2HPO4组成。
[0011]相比其他双水相成相剂，本专利技术提供的双水相成相剂组合物，所述磷酸缓冲液的分相时间更短，所述PEG400溶液亲水性极强，由于其二者搭配使用时优异的分离纯化效果，进一步简化了操作步骤，且对环境友好，更易于规模化工业生产。
[0012]优选的，所述磷酸缓冲液由水、KH2PO4和K2HPO4组成，其中，所述KH2PO4的质量分数为3.92wt％～6.72wt％，所述K2HPO4的质量分数为10.08wt％～17.28wt％；
[0013]所述PEG400溶液由水和PEG400组成，所述PEG400的质量分数为14wt％～24wt％。
[0014]在此浓度范围内，所述磷酸缓冲液与所述PEG400溶液配合紧密，能够更高效的分离纯化样品病毒，从而获得更高的病毒分离纯化效果。
[0015]在一些具体的实施例中，所述磷酸缓冲液由水、KH2PO4和K2HPO4组成，其中，所述KH2PO4的质量分数为5.04wt％，所述K2HPO4的质量分数为12.96wt％；
[0016]所述PEG400溶液由水和PEG400组成，其中，所述PEG400的质量分数为20wt％。
[0017]实验表明，在此浓度范围内，所述磷酸缓冲液与所述PEG400溶液能够更好的配合，分离纯化的效果最好。
[0018]本专利技术提供了所述的双水相成相剂组合物在分离和/或纯化病毒样颗粒中的应用。
[0019]本专利技术所述的病毒样颗粒可为人工合成的各种病毒的病毒样颗粒，例如诺如病毒、HPV病毒、禽流感病毒、腹泻病毒、乙肝病毒、猪圆环病毒、猪细小病毒、带状疱疹病毒、新冠病毒、脑炎病毒等，本专利技术实施例中，以流感病毒样颗粒为例进行纯化效果的验证。更具体的，本专利技术实施例中采用的是H1N1流感病毒样颗粒。
[0020]实验表明，所述的双水相成相剂组合物相比较其他组合物，对流感病毒样颗粒的分离纯化效果尤其优异，可获得高纯度的流感病毒样颗粒，流感病毒样颗粒的结构和活性均得到保持。
[0021]本专利技术提供了双水相分离纯化病毒样颗粒的方法，将病毒样颗粒的粗提液采用所述的双水相成相剂组合物分离纯化。
[0022]优选的，所述粗提液的分离纯化方法包括：
[0023]将所述病毒样颗粒的粗提液中与所述的双水相成相剂组合物混合，静置至形成液
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液两相体系，经初次离心后形成液
‑
固
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液三相体系，回收中间固相；
[0024]所述固相采用PBS溶液溶解，经再次离心后获得病毒样颗粒溶液。
[0025]进一步优选的，所述粗提液的分离纯化温度为18～35℃。
[0026]在一些具体的实施例中，所述粗提液的分离纯化温度为25℃，所述初次离心采用3000rpm离心5min，所述再次离心采用6000rpm离心15min。
[0027]优选的，所述粗提液的制备方法包括：
[0028]构建病毒重组质粒农杆菌，侵染植物组织；
[0029]取植物侵染组织，用TBE提取液破碎浸提；
[0030]浸提后离心，获得所述病毒样颗粒粗提液本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.双水相成相剂组合物，其特征在于，由磷酸缓冲液与PEG400溶液组成，其中，所述磷酸缓冲液由水、KH2PO4和K2HPO4组成。2.如权利要求1所述的双水相成相剂组合物，其特征在于，所述磷酸缓冲液由水、KH2PO4和K2HPO4组成，其中，所述KH2PO4的质量分数为3.92wt％～6.72wt％，所述K2HPO4的质量分数为10.08wt％～17.28wt％；所述PEG400溶液由水和PEG400组成，所述PEG400的质量分数为14wt％～24wt％。3.如权利要求2所述的双水相成相剂组合物，其特征在于，所述磷酸缓冲液由水、KH2PO4和K2HPO4组成，其中，所述KH2PO4的质量分数为5.04wt％，所述K2HPO4的质量分数为12.96wt％；所述PEG400溶液由水和PEG400组成，其中，所述PEG400的质量分数为20wt％。4.权利要求1～3任一项所述的双水相成相剂组合物在分离和/或纯化病毒样颗粒中的应用。5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述病毒样颗粒包括流感病毒样颗粒。6.双水相分离纯化病毒样颗粒的方法，其特征在于，将病毒样颗...

【专利技术属性】
技术研发人员：汪洋，俞保彬，
申请(专利权)人：浙江华缔药业集团医药开发有限公司，
类型：发明
国别省市：