植物叶片离体培养表达蛋白的方法技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，特别涉及植物叶片离体培养表达蛋白的方法。本发明专利技术可以充分将植物叶片进行离体培养，并正常表达产生所需要的重组蛋白。在培养的垂直空间占用上具有非常大的优势，同时不再需要营养土或营养液，成本低廉，价格优势明显，操作简单便捷，适用于大规模的商业化生产使用。

【技术实现步骤摘要】
植物叶片离体培养表达蛋白的方法
本专利技术涉及生物
，特别涉及植物叶片离体培养表达蛋白的方法。
技术介绍
植物作为一种蛋白生产的生物反应器，具有广阔的应用前景。目前生产重组蛋白的植物培养主要是以建造人工气候室或者培养间、培养箱为主。除了生菜等少数蔬菜可以用水培进行大量生产之外，绝大多数植物依然采用的是土培辅助以LED人工光源的方式或者直接在大田进行种植，进行重组蛋白的生产。现有的几个以植物源重组蛋白为主的公司，如Medicago、Ibio等均在培养间内，利用人工LED光源、营养土培养本氏烟、生菜等植物，并采用农杆菌真空浸润法将需要的表达载体导入到植物叶片细胞中。这样的方法可以在植物上快速生产重组蛋白，不受环境条件和土地资源的制约。但这样子的培养方式也存在一定的缺陷：1、营养土比较昂贵且不易回收利用，成本较高；2、营养土的存在给真空浸润造成很多技术难题，增加设备成本；3、植物在立体式的培养模式下，增加了生产场地的空间占用消耗，增加了生产成本。因此，一种更加高效、集约、低成本的植物培养体系和重组蛋白生产体系是十分必要的。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术提供一种植物叶片离体培养表达重组蛋白的方法，利用此方法可以更加简单操作、低成本、短周期地生产植物源重组蛋白。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：本专利技术提供了植物叶片离体培养表达重组蛋白的方法，包括如下步骤：步骤1：构建含有所述重组蛋白的表达载体；步骤2：将步骤1制备的所述表达载体导入宿主，培养，收集菌液浸润到植物叶片，获得含有表达载体的植物叶片；步骤3：取所述含有表达载体的植物叶片置于植物叶片离体培养装置的支撑渗水部件(5)，培养；所述植物叶片离体培养装置包括依次连接的装置覆盖部件(1)、支撑渗水部件(5)、锁水部件(3)和底部承载部件(2)；步骤4：收集培养后的植物叶片，提取蛋白。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述重组蛋白为GFP荧光蛋白，所述表达载体为农杆菌Ti载体pCambia1300。在本专利技术的一些具体实施方案中，步骤1中所述构建含有所述重组蛋白的表达载体采用的上下游引物的序列如SEQIDNo.1和SEQIDNo.2所示。在本专利技术的一些具体实施方案中，步骤1中所述构建含有所述重组蛋白的表达载体选用的扩增体系为：22μlddH2O、25μlKODOneTMPCRMasterMix、1μl10μM上游引物、1μl10μM下游引物、1μl100ng/μl的含有GFP的质粒模板。在本专利技术的一些具体实施方案中，步骤1中所述构建含有所述重组蛋白的表达载体采用的PCR扩增程序：98℃30秒；28个循环：98度10秒；55℃30秒；68℃10秒；最后68℃5分钟；4℃10分钟。在本专利技术的一些具体实施方案中，步骤1中所述含有所述重组蛋白的表达载体的序列如SEQIDNo.3所示。在本专利技术的一些具体实施方案中，步骤2中所述收集菌液浸润到植物叶片具体为：待菌液的OD600＝0.8时，8000rpm离心2分钟，将沉淀的菌液用浸润缓冲液重悬，调节OD600＝0.6，将菌液浸润到植物叶片中；所述浸润缓冲液包括10mMMES，10mMMgCl2，1μM乙酰丁香酮。在本专利技术的一些具体实施方案中，步骤3中所述培养的条件为温度28℃，相对湿度100％，光照强度为250μmoles/m2/s，明暗时间为16h/8h。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述植物叶片为烟草叶片。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述支撑渗水部件(5)的厚度为1～3cm；所述锁水部件(3)的厚度为1～3cm；所述底部承载部件(2)的厚度为10～20cm。本专利技术首次使用离体叶片成功表达外源重组蛋白。因为叶片一旦离体2个小时，就会萎蔫和干枯，细胞就会死亡，无法再表达外源蛋白。结合本专利技术提供的培养装置使得叶片在离体的条件下，保持原本的叶片形态和细胞功能，同时，还能够持续性地表达外源蛋白，并且，该外源蛋白仍然具有生物学活性。用WB的方法检测整株有土栽培提的植株叶片上和离体培养装置内离体培养叶片上所表达的GFP蛋白量的差异。用ImageJ软件计算条带灰度进行统计分析，发现P＝0.96>0.05，这两者之间并没有显著的差异。但是，每立方米培养成本大幅下降：通过成本计算分析，发现体外离体培养叶片方式与传统有土整株栽培方式相比有明显的价格优势，显著降低用植物作为生物反应器生产重组蛋白的成本达66.7％～80.0％。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。图1示离体培养设备示意图，其中1-塑料薄膜(装置覆盖部件)；2-塑料拖盆(底部承载部件)；3-再生保湿锁水棉(锁水部件)；4-离体培养叶片；5-塑料网格架(支撑渗水部件)；图2示1300-eGFP载体图谱；图3示体外离体培养表达重组蛋白；图4示3天WB比较结果。具体实施方式本专利技术公开了一种植物叶片离体培养表达重组蛋白的方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本专利技术。本专利技术的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
技术实现思路
、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本专利技术技术。本专利技术所包含有底部承载装置(可以是塑料、金属材料、复合材料等)(长60～120cm宽40～80cm高10～20cm)(2)、有一定厚度1～3cm厚锁水部件(3)、装置覆盖部件(1)、厚度1～3cm的支撑渗水部件(5)，四部分组成。使用时，将底部承载装置、支撑渗水部件消毒晾干，将锁水部件充分消毒后用双蒸水充分润湿。将锁水部件、支撑渗水部件依次装入承载装置内，将从植物上新鲜摘下并注射过含有1300-eGFP表达载体的农杆菌的本氏烟叶片，正面朝上放置于支撑渗水部件上，最后用装置覆盖部件覆盖整个装置，形成相对密封空间，并在四周用加固部件加固(绳子、皮筋、伸缩夹等)，放入具有LED光源的恒温组织培养间中。本专利技术可以充分将植物叶片进行离体培养，并正常表达产生所需要的重组蛋白。在培养的垂直空间占用上具有非常大的优势，同时不再需要营养土或营养液，成本低廉，价格优势明显，操作简单便捷，适用于大规模的商业化生产使用。本专利技术提供的植物叶片离体培养表达重组蛋白的方法中所用原料及试剂均可由市场购得。下面结合实施例，进一步阐述本专利技术：实施例1植物叶片离体培养装置的制备本专利技术所包含有底部承载装置(可以是塑料、金属材料、复合材料等)(长60～120cm宽40～80cm高10～20cm)②、有一定厚度1～3cm厚锁水部件③、装置覆盖部件①、支撑渗水部件，厚度约1～3cm的⑤四部分组成。使用时，将底部承载装置、支撑渗水部件消毒晾干，将锁水部本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.植物叶片离体培养表达重组蛋白的方法，其特征在于，包括如下步骤：/n步骤1：构建含有所述重组蛋白的表达载体；/n步骤2：将步骤1制备的所述表达载体导入宿主，培养，收集菌液浸润到植物叶片，获得含有表达载体的植物叶片；/n步骤3：取所述含有表达载体的植物叶片置于植物叶片离体培养装置的支撑渗水部件(5)，培养；/n所述植物叶片离体培养装置包括依次连接的装置覆盖部件(1)、支撑渗水部件(5)、锁水部件(3)和底部承载部件(2)；/n步骤4：收集培养后的植物叶片，提取蛋白。/n

【技术特征摘要】
1.植物叶片离体培养表达重组蛋白的方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1：构建含有所述重组蛋白的表达载体；
步骤2：将步骤1制备的所述表达载体导入宿主，培养，收集菌液浸润到植物叶片，获得含有表达载体的植物叶片；
步骤3：取所述含有表达载体的植物叶片置于植物叶片离体培养装置的支撑渗水部件(5)，培养；
所述植物叶片离体培养装置包括依次连接的装置覆盖部件(1)、支撑渗水部件(5)、锁水部件(3)和底部承载部件(2)；
步骤4：收集培养后的植物叶片，提取蛋白。


2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述重组蛋白为GFP荧光蛋白，所述表达载体为农杆菌Ti载体pCambia1300。


3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤1中所述构建含有所述重组蛋白的表达载体采用的上下游引物的序列如SEQIDNo.1和SEQIDNo.2所示。


4.如权利要求1至3任一项所述的方法，其特征在于，步骤1中所述构建含有所述重组蛋白的表达载体选用的扩增体系为：22μlddH2O、25μlKODOneTMPCRMasterMix、1μl10μM上游引物、1μl10μM下游引物、1μl100ng/μl的含有GFP的质粒模板。


5.如权利要求1至4...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑蔚，周昕，赵启超，翟璐，濮云飞，
申请(专利权)人：浙江华缔药业集团医药开发有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33