【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因检测，具体涉及一种用于鉴别结核分枝杆菌复合群和非结核分枝杆菌的引物组及其应用。
技术介绍
1、分枝杆菌科(mycobacteriaceae)隶属放线菌门，共含5个属，分枝杆菌属(mycobacterium)、分枝酸杆菌属(mycolicibacter)、分枝酸棒菌属(mycolicibacillus)、拟分枝酸杆菌属(mycobacteroides)和分枝酸菌属(mycolicibacterium)。分枝杆菌为形状不规则的革兰氏阳性杆菌，不能游动，通常抗酸，无气生菌丝和孢子。
2、非结核分枝杆菌(non-tuberculous mycobacteria，ntm)是分枝杆菌中除结核分枝杆菌复合群(mycobacterium tuberculosis complex，mtbc)和麻风分枝杆菌之外的一类分枝杆菌。ntm是一种环境生长菌，目前已鉴别出190余种，对人体具有致病性的有40余种。临床上发现的ntm感染多为支气管扩张和慢性阻塞性肺疾病患者的并发感染，且ntm肺病的临床症状、x射线表现与肺结核相似，但治疗方案差别明显，临床上易误诊误治，使得患者病程迁延。随着分子诊断技术的不断改进和学科认知的普及，在世界范围内，ntm病的发病率均逐年上升。
3、结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌在形态学及图片抗酸染色上难以鉴别，其临床治疗差别较大，许多非结核分枝杆菌对抗结核药物天然耐药，常规化疗效果不佳。因此，目前分枝杆菌的鉴定对结核病的诊断、鉴别诊断和有效化疗具有重要意义。正确快速鉴别分枝杆菌，可避免误诊误治
4、目前的分枝杆菌鉴定方法多数基于多重pcr技术，包含实时荧光定量pcr技术、等温扩增技术、探针-反向杂交技术和探针-熔解曲线技术等，均较为方便、快捷，但这些试剂多基于某个特定snp位点进行菌种鉴别，可鉴别的菌种有限，也难以做到亚种的鉴别。
5、目前的分枝杆菌临床常用的一代测序菌种鉴定方法多基于16s rrna区域，但是16srrna区域分辨力不足，一些亲缘关系相近的菌种无法被准确鉴别。因此，开发一种高效准确的分枝杆菌鉴定的方法学和引物组在结核病/ntm病的检测中具有重要的应用价值。
技术实现思路
1、针对现有技术存在的不足，本专利技术的目的在于提供一种用于鉴别结核分枝杆菌复合群和非结核分枝杆菌的引物组及其应用。本专利技术结合多重pcr技术和靶向高通量测序技术(targeted next-generation sequencing，tngs)，通过对靶标的超多重pcr扩增富集提高检测灵敏度，基于基因测序平台(illumina)的序列读取提高检测特异性，从而实现精准而灵敏的分枝杆菌的鉴别，检测成本低、检测周期短、灵敏度高、特异性好，且可有效鉴别混合感染。
2、为达到此专利技术目的，本专利技术采用以下技术方案：
3、第一方面，本专利技术提供一种用于鉴别结核分枝杆菌复合群和非结核分枝杆菌的引物组，所述引物组包括seq id no:1-118所示的核苷酸序列。
4、优选地，所述引物组还包括特异性扩增内参基因的引物。
5、优选地，所述内参基因为人锌指蛋白基因。
6、优选地，所述特异性扩增内参基因的引物包括seq id no:119-120所示的核苷酸序列。
7、优选地，所述引物组中每条引物序列上还连接有公共序列。
8、优选地，所述公共序列包括seq id no:121所示的核苷酸序列。
9、本专利技术中，通过查阅文献、公共数据库，收集分枝杆菌的基因组数据库及其常见鉴定基因，常见鉴定基因如结核分枝杆菌复合群的is6110、is1081、mtp64或rpob等，非结核分枝杆菌的16s rrna、rpob、hsp65或its等，找到鉴定基因后并对鉴定基因设计特异性引物序列，同时设计内参特异性引物序列，得到用于鉴别结核分枝杆菌复合群和非结核分枝杆菌的引物组。
10、在菌株鉴定过程中，同一个菌种的不同菌株的序列有一定差异，其中标志性snp(单个位点或某个区域或某几个区域)在该菌种的不同菌株或其亲缘关系相近的菌种的不同菌株都存在，一对引物序列可同时扩增多个菌种，其中可通过标志性snp鉴别部分菌种；多对引物联合，可实现菌种的精准鉴别。
11、第二方面，本专利技术提供一种用于鉴别结核分枝杆菌复合群和非结核分枝杆菌的试剂盒，所述试剂盒中包括第一方面所述的用于鉴别结核分枝杆菌复合群和非结核分枝杆菌的引物组。
12、优选地，所述试剂盒还包括测序接头和封闭引物。
13、本专利技术中，每条特异性引物序列5’端连接公共序列(5’-gactgccgctggttggatg-3’，seq id no:121)作为pcr引物序列，公共序列的作用为连接测序接头与每条特异性引物。illumina平台的测序接头3’端连接该公共序列作为测序接头引物，公共序列的作用为连接pcr引物及扩增目标区域。
14、优选地，所述封闭引物包括seq id no:122所示的核苷酸序列。
15、本专利技术中，将公共序列的反向互补序列作为封闭引物(5’-catccaaccagcggcagtc-3’，seq id no:122)，在pcr引物序列扩增样本目标区域过程中，避免接头引物与特异性引物进行连接。
16、优选地，所述测序接头还连接有公共序列。
17、第三方面，本专利技术提供一种鉴别结核分枝杆菌复合群和非结核分枝杆菌的装置，所述装置包括：
18、建库单元：采用第二方面所述的用于鉴别结核分枝杆菌复合群和非结核分枝杆菌的试剂盒配制建库引物体系，对模板dna进行超多重pcr扩增，获得超多重pcr文库；
19、测序单元：对所述超多重pcr文库进行纯化和高通量测序；
20、分析单元：根据高通量测序测序结果鉴别结核分枝杆菌复合群和非结核分枝杆菌。
21、优选地，所述建库引物体系包括：引物组、测序接头和封闭引物。
22、优选地，所述建库引物体系中引物组、测序接头和封闭引物按照(4-5):(2-2.5):(0.8-1.2)的比例进行混合，比例例如可以是4:2:0.8、4:2.5:0.8、4:2.5:1.2、5:2:0.8、5:2.5:0.8或5:2.5:1.2等。
23、优选地，所述超多重pcr文库的结构为illumina测序接头-公共序列-目标区域-公共序列-illumina测序接头。
24、本专利技术中，采用一步法进行超多重pcr文库的构建，illumina平台的常规的pcr建库步骤为使用引物组进行核酸扩增，扩增产物末修后再进行接头连接，需要进行两轮pcr扩增，一般口头表述为两步法建库；我们的一步法建库是在扩增的同时进行接头连接，只需要进行一轮pcr扩增，因此称为一步法建库。整个文库构建过程无需开盖，避免污染；节省人工操作。
25、第四方面，本本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种用于鉴别结核分枝杆菌复合群和非结核分枝杆菌的引物组，其特征在于，所述引物组包括SEQ ID NO:1-118所示的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的用于鉴别结核分枝杆菌复合群和非结核分枝杆菌的引物组，其特征在于，所述引物组还包括特异性扩增内参基因的引物；
3.根据权利要求1或2所述的用于鉴别结核分枝杆菌复合群和非结核分枝杆菌的引物组，其特征在于，所述引物组中每条引物序列上还连接有公共序列；
4.一种用于鉴别结核分枝杆菌复合群和非结核分枝杆菌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括权利要求1-3中任一项所述的用于鉴别结核分枝杆菌复合群和非结核分枝杆菌的引物组。
5.根据权利要求4所述的用于鉴别结核分枝杆菌复合群和非结核分枝杆菌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括测序接头和封闭引物；
6.一种鉴别结核分枝杆菌复合群和非结核分枝杆菌的装置，其特征在于，所述装置包括：
7.根据权利要求6所述的鉴别结核分枝杆菌与非结核分枝杆菌的装置，其特征在于，所述建库引物体系包括：引物组、测序接头和封闭引物；
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