泌尿生殖道病原微生物核酸的快速联合检测制造技术

泌尿生殖道病原微生物核酸的快速联合检测。本发明专利技术提供的基于CRISPR/Cas12a的试剂盒可用于检测临床常见泌尿生殖道病原微生物感染，具有极高的灵敏度和特异性，其中的引物组合能够在恒温扩增过程中不会互相干扰，结合特异性crRNA，能够明显提升反应速度和检测灵敏度，为妇科病原体的快速检测提供了便捷方法。为妇科病原体的快速检测提供了便捷方法。

【技术实现步骤摘要】
泌尿生殖道病原微生物核酸的快速联合检测


[0001]本专利技术涉及病原微生物核酸检测
，具体涉及泌尿生殖道淋病奈瑟菌、沙眼衣原体和细小脲原体核酸的检测。

技术介绍

[0002]淋病和非淋菌性尿道炎均属于常见的性传播疾病，可导致男性尿道炎、前列腺炎和女性阴道炎、宫颈炎、盆腔炎和不孕症等，还可导致女性早产、流产、宫颈癌，对人类健康造成极大的危害。在性传播疾病中，淋病奈瑟菌、沙眼衣原体和和解脲支原体是泌尿生殖系统性传播疾病的三个最常见病原体，常呈多重感染状态，及时诊断及确定病原微生物的种类可以指导医生合理用药，避免无效治疗和抗生素滥用。
[0003]淋病奈瑟菌为淋病病原菌，是一种严格的人体寄生菌，常存在于尿道炎或阴道炎的脓性分泌物的细胞中，对人体有很强的适应性和侵袭性，其可造成黏膜上皮损伤，影响其正常分泌功能，从而引发不孕。淋病在我国人群中有很高的发病率，感染淋病奈瑟菌初期一般无临床症状，但任其持续发展会引起严重的泌尿生殖道疾病，及时准确诊断淋病奈瑟菌感染是治疗淋病的关键。
[0004]沙眼衣原体感染是常见病的性传播疾病，主要表现为感染柱状上皮细胞和移行上皮细胞而不向深层侵犯，是一种严格的胞内寄生菌。感染沙眼衣原体前期可能无明显临床症状，但随着感染发生，沙眼衣原体产生的代谢产物所引发的毒性会引发变态反应，从而导致组织损伤，对器官的正常功能造成影响。我国沙眼衣原体检出率呈逐年上升趋势，因此选择敏感、特异、快速方法辅助沙眼衣原体感染的早诊断早治疗有重要意义。
[0005]解脲脲原体是一种原核细胞微生物，为人类泌尿生殖道感染常见病原菌之一，可引发宫颈炎、盆腔炎、前列腺炎甚至不孕不育等症状或并发症。近年来，解脲脲原体导致的泌尿生殖道感染发病率呈增长趋势，其致病性与血清型及生物群有关，解脲脲原体中细小脲原体占主要比例，致病菌尤以血清型1、3、6、14型为主。
[0006]淋病奈瑟菌、沙眼衣原体和细小脲原体感染后主要引起泌尿生殖道局部炎症及一系列病理改变，三者之间无明显临床症状差异，且呈混合感染。因此，临床上常需要对3种病原体进行同时检测。传统的检测方法如培养法、免疫法灵敏度低，且无法区分种群，在临床上存在很大的局限性。因此，针对3种病原微生物的高灵敏度、高特异型的快速检测方法对提高临床诊断治疗水平及流行病学调查具有重要意义。

技术实现思路

[0007]本专利技术的目的在于提供一种基于CRISPR/Cas12a的检测泌尿生殖道病原微生物检测试剂及其应用，可快速、高灵敏度、高特异型地检测淋病奈瑟菌、沙眼衣原体和细小脲原体。
[0008]在本专利技术的第一方面，提供了一种用于检测淋病奈瑟菌、沙眼衣原体和细小脲原体的适用于多重恒温扩增的引物对集，所述引物对集包括：
[0009]淋病奈瑟菌：
[0010]上游引物NG
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F：GCGAATCCGTTTGGCGATGCCAGCAAAGCCATTGA
[0011]下游引物NG
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R：CGTGAAAGTAGCAGGCGTATAGGCGGACTTGCT
[0012]沙眼衣原体：
[0013]上游引物CT
‑
F：GAGCGAGTTACGAAGACAAAACCTCTTCGTTGACC
[0014]下游引物CT
‑
R：CTGAAGTCTTAAGCTTGGAGATTAGTCAGATTTG
[0015]细小脲原体：
[0016]上游引物UP
‑
F：ATCTGGTGGGGATAATTTATCTGCAACATTTAGTCC
[0017]下游引物UP
‑
R：CCACGTGATTTTAATGTATCGGCTTTCATTAC
[0018]人内参基因：
[0019]上游引物内参
‑
F：GACCACAGTCCATGCCATCACTGCCACCCAGAAGA
[0020]下游引物内参
‑
R：GGAAATGAGCTTGACAAAGTGGTCGTTGAGGGCAA
[0021]本专利技术的第二方面，提供了针对泌尿生殖道病原微生物淋病奈瑟菌、沙眼衣原体和细小脲原体的特异性识别crRNAs，所述特异性识别crRNA包括：
[0022]核苷酸序列如SEQ ID NO.9所述的淋病奈瑟菌NG
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crRNA：UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUAAACGCCACGACGGUAUGCCG
[0023]核苷酸序列如SEQ ID NO.10所述的沙眼衣原体CT
‑
crRNA：UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUUGUCUGACGGUUCUUAAGCUG
[0024]核苷酸序列如SEQ ID NO.11所述的细小脲原体UP
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crRNA：UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUUAUCAUUGAUGUUGCACAAGG
[0025]核苷酸序列如SEQ ID NO.12所述的内参
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crRNA：
[0026]UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUUGUAGCUGGGGGCCUGGGCUG
[0027]本专利技术的第三方面，提供了一种用于多重检测泌尿生殖道病原微生物核酸的试剂盒，所述试剂盒包括本专利技术第一方面所述的引物对集和第二方面所述的特异性crRNAs。
[0028]在另一优选例中，所述试剂盒包括第一容器内包含兼容恒温扩增的快速核酸释放剂。
[0029]在另一优选例中，所述试剂盒包括第二容器内包含混合引物对，所述混合引物对包含SEQ ID NO.1
‑
8所示的多核甘酸序列，所述混合引物对包括淋病奈瑟菌扩增引物15pmol、沙眼衣原体扩增引物10pmol、细小脲原体扩增引物15pmol和人内参基因扩增引物8pmol；所述第二容器内还包含恒温扩增Buffer、MgOAc和恒温扩增酶系等；所述第二容器内容物为冻干形式。
[0030]在另一优选例中，所述试剂盒包括第三容器，所述第三容器内包含阴性参考品，所述阴性参考品为生理盐水。
[0031]在另一优选例中，所述试剂盒包括第四容器，所述第四容器内包含特异性检测淋病奈瑟菌的CRISPR/Cas反应体系，所述CRISPR/Cas反应体系包括检测Buffer、RNA酶抑制剂、Cas12蛋白、ssDNA FQ reporter、NG
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crRNA；所述CRISPR/Cas反应体系为冻干形式。
[0032]在另一优选例中，所述试剂盒包括第五容器，所述第五容器内包含特异性检测淋病奈瑟菌的CRISPR/Cas反应体系，所述CRISPR/Cas反应体系包括检测Buffer、RNA酶抑制剂、Cas12蛋白、ssDNA FQ reporter、CT
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crRNA；所述CRISPR/Cas反应体系为冻干形式。
[0033]在另一优选例中，所述试本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于泌尿生殖道病原微生物核酸快速检测的CRISPR/Cas12a试剂盒，包括适用于淋病奈瑟菌、沙眼衣原体、细小脲原体和人内参基因快速检测的恒温扩增体系和CRISPR/Cas12a检测体系，其中，所述恒温扩增体系包括：针对淋病奈瑟菌的上游扩增引物NG
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F(SEQ ID NO.1)和下游扩增引物NG
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R(SEQ ID NO.2)；针对沙眼衣原体的上游扩增引物CT
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F(SEQ ID NO.3)和下游扩增引物CT
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R(SEQ ID NO.4)；针对细小脲原体的上游扩增引物UP
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F(SEQ ID NO.5)和下游扩增引物UP
‑
R(SEQ ID NO.6)；以及针对人内参基因的上游扩增引物内参
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F(SEQ ID NO.7)和下游扩增引物内参
‑
R(SEQ ID NO.8)，其中所述CRISPR/Cas12a检测体系包括：针对淋病奈瑟菌的特异性识别NG
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crRNA(SEQ ID NO.9)；针对沙眼衣原体的特异性识别CT
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crRNA(SEQ ID NO.10)；针对细小脲原体的特异性识别UP
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crRNA(SEQ ID NO.11)；以及针对内参基因的
‑
crRNA(SEQ ID NO.12)。2.如权利要求1所述的试剂盒，还包括第一容器，第一容器内包含兼容恒温扩增的快速核酸释放剂。3.如权利要求2所述的试剂盒，还包括第二容器，第二容器内包含恒温扩增引物对。4.如权利要求3所述的试剂盒，其中第二容器内还包括扩增Buffer、MgOAc、扩增引物和反应酶系，所述恒温扩增体系为冻干形式。5.如权利要求3所述的试剂盒，还包括第三容器，第三容器内包含阴性对照品。6.如权利要求3所述的试剂盒，还包括第四容器，第四容器内包含特异性检测淋病奈瑟菌的CRISPR/Cas反应体系：检测Buffer、RNA酶抑制剂、Cas12蛋白、ssDNA FQ reporter、NG
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crRNA。7.如权利要求3所述的试剂盒，还包括第五容器，第五容器内包含特异性检测沙眼衣原体的CRISPR/C...

【专利技术属性】
技术研发人员：马旭，张璐，金孝华，
申请(专利权)人：国家卫生健康委科学技术研究所，
类型：发明
国别省市：