一种基于RPA检测烟粉虱体内共生菌Rickettsia的检测方法技术

本发明专利技术属于农业生物技术领域，本发明专利技术提供了一种基于RPA检测烟粉虱体内共生菌Rickettsia的检测方法。本发明专利技术技术方案利用RPA技术，以携带Rickettsia的烟粉虱为材料，提取基因组DNA，并以此为模板，通过反应条件优化、特异性及灵敏度检测等试验，建立一种高效、便捷、省时、特异性好、灵敏度较高的检测烟粉虱体内共生菌Rickettsia的方法，为田间快速检测提供了技术支持，并为烟粉虱与Rickettsia的互作机制研究奠定了基础。作机制研究奠定了基础。作机制研究奠定了基础。

【技术实现步骤摘要】
一种基于RPA检测烟粉虱体内共生菌Rickettsia的检测方法


[0001]本专利技术涉及农业生物
，尤其涉及一种基于RPA检测烟粉虱体内共生菌Rickettsia的检测方法。

技术介绍

[0002]烟粉虱Bemisia tabaci(Gennadius)是重要的世界性农业害虫之一，被冠以“超级害虫”的称谓，被列为最危险的100种入侵物种。烟粉虱不仅通过直接刺吸汁液为害寄主植物，而且分泌蜜露导致霉污病滋生而影响植物的光合作用和呼吸作用，更重要是烟粉虱作为病毒的超级载体，能够传播极具破坏性的植物病毒病，每年造成数十亿美元的经济损失。烟粉虱是一个物种复合体，至少包含36个隐种，其中MEAM1隐种(B型)和MED(Q型)是两种入侵性烟粉虱，成为田间为害的优势种。
[0003]Rickettsia属于变形菌纲Proteobacteria的α亚群立克次体科Rickettsiaceae革兰氏阴性菌。Rickettsia于1909年在研究洛基山斑疹热时首次发现，通常将Rickettsia分为感染脊椎动物的致病菌和感染节肢动物的共生菌。Rickettsia作为烟粉虱体内重要的次生共生菌，可通过垂直和水平的方式在烟粉虱种群传播。研究表明，Rickettsia对烟粉虱的生殖、发育、抗药性等都有重要影响，且在不同种群和隐种间的感染率不同。
[0004]目前对Rickettsia的检测主要依赖于16S或23SrRNA的PCR扩增和测序，但受引物和灵敏度限制而易出现假阴性，且测序验证较耗时。实时荧光定量PCR被广泛用于Rickettsia滴度的检测，虽然其灵敏度更高，但是操作步骤繁琐且耗时耗力。此外，对Rickettsia的检测方法还包括荧光原位杂交(FISH)、16SrDNA扩增子测序等，然而FISH设备昂贵，操作困难，而16SrDNA扩增子测序侧重于微生物群落多样性研究。综上所述，目前对烟粉虱体内共生菌Rickettsia的检测存在假阴性、操作繁琐、设备昂贵、耗时耗力等不足，因此急需一种快速高效检测烟粉虱体内Rickettsia的方法。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于提供一种基于RPA检测烟粉虱体内共生菌Rickettsia的检测方法，利用RPA技术，以携带Rickettsia的烟粉虱的基因组DNA为模板，通过反应条件优化、特异性及灵敏度检测等试验建立的检测方法，从而实现快速、准确地检测烟粉虱体内Rickettsia的目的，同时缩减了鉴定时间，节约了生化试剂，降低了成本，为烟粉虱体内共生菌Rickettsia的快速、高效检测提供技术保障。
[0006]为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：
[0007]本专利技术提供了一种基于RPA检测烟粉虱体内共生菌Rickettsia的检测引物组，所述引物组包括引物Ric
‑
RPAF和引物Ric
‑
RPAR，所述引物Ric
‑
RPAF的序列如SEQ ID NO.2所示，所述引物Ric
‑
RPAR的序列如SEQ ID NO.3所示。
[0008]本专利技术还提供了一种基于RPA检测烟粉虱体内共生菌Rickettsia的检测试剂盒，包括上述的检测引物组。
[0009]本专利技术还提供了一种基于RPA检测烟粉虱体内共生菌Rickettsia的检测方法，包括如下步骤：
[0010](1)提取所述烟粉虱基因组DNA；
[0011](2)以步骤(1)得到的基因组DNA为模板，采用上面所述的引物组进行RPA扩增，得到RPA扩增产物；
[0012](3)检测步骤(2)得到的RPA扩增产物中是否存在如SEQ ID No.3所述的序列，若存在，表明被测样品被共生菌Rickettsia感染；若不存在，表明被检测样品为未被共生菌Rickettsia感染。
[0013]作为优选，步骤(2)所述RPA扩增的扩增体系以50μl计，包括以下组分：Rehydration Buffer 29.5μl，去离子水13.0μl，引物Ric
‑
RPAF、引物Ric
‑
RPAR各2μl，模板DNA 1μl，醋酸镁溶液2.5μl。
[0014]作为优选，所述引物Ric
‑
RPAF、引物Ric
‑
RPAR的浓度为0.1
‑
0.6μmol/L，所述模板DNA的浓度为120
‑
180ng/μl。
[0015]作为优选，步骤(2)所述RPA扩增的温度为35
‑
42℃，所述RPA扩增的时间为10
‑
40min。
[0016]作为优选，采用1
‑
2％琼脂糖凝胶电泳的方法检测步骤(2)得到的RPA扩增产物。
[0017]通过采用上述技术方案，本专利技术具有如下有益效果：
[0018]本专利技术根据共生菌Rickettsia的基因组中具有物种特异性的Pgt基因片段设计RPA引物，获得Rickettsia
‑
RPA检测体系，该检测体系特异性强，除粉虱体内的Rickettsia以外的共生菌均不能扩增出条带；灵敏度较高，RPA的检测限度为150
×
10
‑3ng/μl，比普通PCR灵敏10倍；还可以实现快速、准确地检测烟粉虱体内Rickettsia的目的，同时缩减了鉴定时间，节约了生化试剂，降低了成本，大大提高了Rickettsia在烟粉虱体内的检测效率，也为烟粉虱体内共生菌Rickettsia的快速、高效检测提供技术保障。
附图说明
[0019]图1为Rickettsia
‑
RPA不同反应时间的检测结果(M：2000bp DNA Marker；泳道1
‑
5分别为10
‑
50min反应时间)；
[0020]图2为RPA反应特异性检测结果(M：2000bp DNA Marker；1：携带Portiera、Hamiltonella和Rickettsia的MEAM1；2：抗生素去除共生菌的MEAM1；3：携带Portiera、Hamiltonella和Rickettsia的MED；4：携带Portiera、Hamiltonella和Cardinium的MED；5：携带Portiera和Arsenophonus的温室白粉虱；6：ddH2O；A：分别以Portiera、Hamiltonella、Rickettsia、Cardinium和Arsenophonus相应的引物组通过PCR技术检测；B：Rickettsia的RPA技术检测)；
[0021]图3为RPA灵敏度检测结果(M：2000bp DNAMarker；1
‑
5：模板分别为100、10
‑1、10
‑2、10
‑3、10
‑4倍的烟粉虱基因组DNA；A：普通PCR；B：RPA)；
[0022]图4为R本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于RPA检测烟粉虱体内共生菌Rickettsia的检测引物组，其特征在于，所述引物组包括引物Ric
‑
RPAF和引物Ric
‑
RPAR，所述引物Ric
‑
RPAF的序列如SEQ ID NO.2所示，所述引物Ric
‑
RPAR的序列如SEQ IDNO.3所示。2.一种基于RPA检测烟粉虱体内共生菌Rickettsia的检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的检测引物组。3.一种基于RPA检测烟粉虱体内共生菌Rickettsia的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)提取所述烟粉虱基因组DNA；(2)以步骤(1)得到的基因组DNA为模板，采用权利要求1所述的引物组进行RPA扩增，得到RPA扩增产物；(3)检测步骤(2)得到的RPA扩增产物中是否存在如SEQ ID No.1所述的序列，若存在，表明被测样品被共生菌Rickettsia感染；若不存在，表明被检测样品为未被共生菌Rickettsia感染。4.根据权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：李玉婷，李兴烨，栾军波，郑康吾，
申请(专利权)人：沈阳农业大学，
类型：发明
国别省市：