一种大白菜根肿病根际细菌群落的鉴定方法技术

本发明专利技术公开了一种大白菜根肿病根际细菌群落的鉴定方法，所述方法包括以下步骤：S1、样品采集；S2、土壤指标测定：对土壤样品进行pH值、水溶性盐、有机质、土壤全氮、土壤碱解氮、土壤全磷、土壤有效磷、土壤全钾、土壤速效钾、土壤微生物量碳氮磷等指标进行测定；S3、DNA的分离；S4、DNA测序：根据标准方法，在Illumina Miseq平台上执行Illumina Miseq双末端测序过程，原始数据使用Trimmomatic进行质量控制，同时使用FLASH进行序列合并，序列数据上传于NCBI中；S5、统计分析：所得数据用平均值

【技术实现步骤摘要】
一种大白菜根肿病根际细菌群落的鉴定方法


[0001]本专利技术涉及微生物
，更具体的说是涉及一种大白菜根肿病根际细菌群落的鉴定方法。

技术介绍

[0002]大白菜是中国日常饮食中最基本的蔬菜之一，已经有3000多年的种植历史。大白菜根肿病是一种典型的生态学障碍。根肿病是一种由芸薹根肿菌(Plasmodiophora brassicas Wor)引起的土传病害，广泛存在于芸薹科蔬菜中。随着蔬菜品种的更替以及各种真菌和细菌的侵染，根肿病在280年前被首次发现。大白菜非常容易感染根肿病，且受根肿病的影响较大，根据以往的数据，大白菜根肿病的发病率已经达到60％以上。感染根肿病后的蔬菜，其常见症状是根部肿大、地上部分萎蔫、生长停滞，这严重限制了蔬菜的产量和品质。由于引起根肿病发生的芸薹根肿菌的休眠孢子囊在土壤中长期存活，目前缺乏彻底根除根肿病的有效方法。因此，对十字花科根肿病的有效防治措施值得我们特别关注和研究。
[0003]长期以来，有效控制根肿病的发生已经成为了国内外的一项难题，并且吸引了国内外大量科学家的关注。目前，预防和治疗根肿病的有效措施主要有：化学农药、生石灰调酸以及生物防治。化学农药被认为是最有效的防控措施，但化学农药具有容易产生抗药性、环境污染以及降低食品品质和安全的局限性。目前，大部分研究集中在根肿病的生物防治上，生物防治是一种更具可持续性和环境友好型的方法，同时，已经发掘出一批根肿病生物防治的菌株。然而，大多数研究侧重于外源性的菌株防治效果和影响，忽视了大白菜根际土壤和根系中中分离的有效微生物在防控根肿病中的关键作用。
[0004]土壤微生物的组成与土壤的养分循环和结构密切相关，这可能会进一步影响植物病害的发生和传播。较丰富的微生物多样性可以为植物提供更强的保护，防止有害病原菌的侵染。随着生物信息学的发展，植物病害感染的土壤微生物群落的变化已经成为评估植物病害发展和潜力的有效途径。

技术实现思路

[0005]本专利技术要解决的技术问题是提供一种大白菜根肿病根际细菌群落的鉴定方法，以克服现有技术的不足。
[0006]本专利技术的技术方案如下。
[0007]一种大白菜根肿病根际细菌群落的鉴定方法，所述方法包括以下步骤：
[0008]S1、样品采集：选用8～12棵大白菜及其根际土壤储存于冰袋中，12h内到达实验室，用无菌PBS缓冲液冲洗，离心获得根际附着土壤，分别收集植株样品和土壤样品储存在
‑
80℃；
[0009]S2、土壤指标测定：对土壤样品进行pH值、水溶性盐、有机质、土壤全氮、土壤碱解氮、土壤全磷、土壤有效磷、土壤全钾、土壤速效钾、土壤微生物量碳氮磷等指标进行测定；
[0010]S3、DNA的分离：使用土壤试剂盒对DNA进行提取，通过PCR系统进行扩增，引物如下：细菌V3
‑
V4区的515F(5
’‑
GGACTACVSGGGTATCTAAT
‑3’
)和806R(5
’‑
GTGCCAGCCMGCCGGTAA
‑3’
)，反应条件：95℃下30分钟；然后在95℃下30个循环30秒；在55℃下退火30秒；在72℃下延伸30秒；在72℃下延长10分钟；反应体积20μL：含有5μL DNA、0.2μL引物(10μM)、10μLSYBR再生剂和4.8μL超纯水以维持体积；
[0011]S4、DNA测序：根据标准方法，在Illumina Miseq平台上执行Illumina Miseq双末端测序过程，原始数据使用Trimmomatic进行质量控制，同时使用FLASH进行序列合并，序列数据上传于NCBI中，注册号为PRJNA 844280；
[0012]S5、统计分析：所得数据用平均值
±
标准差表示，并用SPSS 20.0软件进行数据分析。
[0013]优选的，所述步骤S5中，数据分析包括组间差异和微生物数据分析；其中，组间差异采用克鲁斯卡尔
‑
沃利斯检验(Kruskal
‑
Wallis)和邓肯检验(Duncan post
‑
hoc test)进行分析；微生物数据分析包括以下部分：α多样性通过Ace和Shannon指数进行评估，并与ANOVA进行比较；β多样性通过基于加权和非加权unifrac距离算法的主坐标分析发现不同处理组间差异；使用Lefse以确定不同处理之间的不同微生物群落或物种结构差异；采用RDA分析方法分析土壤理化性质与微生物群落的相关性。
[0014]本专利技术的有益效果：通常，细菌的组成和结构是与土壤健康密切相关的同时也是可以影响植物健康的重要因素。本专利技术借助高通量测序技术，通过鉴定根肿病感染土壤的微生物组成，揭示了与根肿病发生相关的土壤微生物群落的组成和结构，可用于预测根肿病的发生，并为其生物防治开发潜在的工程菌提供数据支撑。
附图说明
[0015]图1为大白菜根肿病根部形态LR(左)和HR(右)的对比图；
[0016]图2为LR和HR土壤及根系细菌群落组成图(其中图a为LR和HR土壤中细菌种类的相对丰度，图b为LR和HR土壤中细菌种类的分类差异，图c为LR和HR大白菜根系直接细菌种类的相对丰度，图c为LR和HR大白菜根系直接细菌种类的分类差异)。
具体实施方式
[0017]下面结合具体实施例对本做进一步的解释性说明，需要指出的是以下实施方式仅是以例举的形式对本专利技术所做的解释性说明，任何本领域的技术人员以本专利技术的精神对本专利技术所做的等效的替换均落入本专利技术的保护范围。
[0018]实施例1
[0019]大白菜品种及栽培时间.
[0020]品种：义和秋；
[0021]移栽日期：2020.09.08，5片真叶；行距50cm，株距40cm；
[0022]植株取样日期：2020.11.04；
[0023]土壤样品采集时间2020.11.04，移栽后56天；
[0024]地点：青岛胶州市铺集镇胶河源白菜基地(36.11
°
N，119.71
°
E)；
[0025]土壤基础情况：土壤类型为棕壤土，土壤有机质含量为13.22g/kg、碱解氮
50.25mg/kg、速效磷82.40mg/kg、速效钾195.50mg/kg、PH值6.40，浇灌。
[0026]实施例2
[0027]样品采集。
[0028]研究共选用10棵大白菜及其根际土壤，根据病害程度共分为两组(L组1
‑
5号，根肿病发生严重程度较低，病情指数＜10％，健康植株；H组1
‑
5号，根肿病发生程度较高，病情指数≥85％)。收集的植株样品储存于冰袋中，12h内到达实验室，用无菌PBS缓冲液冲洗，离心获得根际附着土壤，收集植株样品和土壤样品储存在
‑
80℃进行分析，新鲜土壤样品用于理化指标检测
[002本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种大白菜根肿病根际细菌群落的鉴定方法，其特征在于包括以下步骤：S1、样品采集：选用8～12棵大白菜及其根际土壤储存于冰袋中，12h内到达实验室，用无菌PBS缓冲液冲洗，离心获得根际附着土壤，分别收集植株样品和土壤样品储存在
‑
80℃；S2、土壤指标测定：对土壤样品进行pH值、水溶性盐、有机质、土壤全氮、土壤碱解氮、土壤全磷、土壤有效磷、土壤全钾、土壤速效钾、土壤微生物量碳氮磷等指标进行测定；S3、DNA的分离：使用土壤试剂盒对DNA进行提取，通过PCR系统进行扩增，引物如下：细菌V3
‑
V4区的515F(5
’‑
GGACTACVSGGGTATCTAAT
‑3’
)和806R(5
’‑
GTGCCAGCCMGCCGGTAA
‑3’
)，反应条件：95℃下30分钟；然后在95℃下30个循环30秒；在55℃下退火30秒；在72℃下延伸30秒；在72℃下延长10分钟；反应体积20μL：含有5μL DNA、0.2μL引物(10μM)、10μLSYBR再生剂和4.8μL超纯水以维持体...

【专利技术属性】
技术研发人员：王涵，倪海平，涂强，卞小莹，张友明，武玉侠，李亦放，
申请(专利权)人：德州迈科生物技术有限公司青岛和协生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：