高丝氨酸脱氢酶突变体及其在生产L-高丝氨酸中的应用制造技术

本发明专利技术属于生物工程领域，具体公开酶活提高的高丝氨酸脱氢酶突变体及其在制备L

【技术实现步骤摘要】
高丝氨酸脱氢酶突变体及其在生产L
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高丝氨酸中的应用


[0001]本专利技术属于生物工程领域，具体公开酶活提高的高丝氨酸脱氢酶突变体及其在制备L
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高丝氨酸或其衍生物中的应用。

技术介绍

[0002]L
‑
高丝氨酸是一种少数的没有被大规模生产的非蛋白质类氨基酸，是一种非必需的手性氨基酸，是苏氨酸、甲硫氨酸、赖氨酸等天冬氨酸家族氨基酸的重要前体。在制药，化妆品，农业以及香料方面有重要应用。L
‑
高丝氨酸由于其具有与农药L
‑
草铵膦相同的化学骨架，已被考虑为L
‑
草铵膦的合成前体，相比化学法具有更好的经济性。
[0003]此外，L
‑
高丝氨酸及其衍生物也是生产许多重要化合物的潜在平台，包括1,4
ꢀ‑
丁二醇、异丁醇、2,4
‑
二羟基丁酸酯、1,3
‑
丙二醇。
[0004]在大肠杆菌、谷氨酸棒杆菌等微生物中，L
‑
高丝氨酸的生物合成是从天冬氨酸支路途径开始的。葡萄糖经过糖酵解途径、磷酸戊糖途径和TCA循环等生成草酰乙酸，随后进入天冬氨酸支路途径。然后天冬氨酸前体在天冬氨酸激酶（Aspartokinase，EC: 2.7.2.4）、天冬氨酸半醛脱氢酶（Aspartate
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semialdehyde dehydrogenase，EC: 1.2.1.11）和高丝氨酸脱氢酶（Homoserine dehydrogenase，EC: 1.1.1.3）等催化下最终生成L
‑
高丝氨酸。其中高丝氨酸脱氢酶是高丝氨酸、苏氨酸、赖氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸等天冬氨酸家族氨基酸合成途径中的共同关键酶，其催化活性常受到末端产物或中间代谢物的反馈抑制或阻遏效应。
[0005]因此，通过筛选或分子改造高丝氨酸脱氢酶，获得具有优良的催化性能的关键酶突变体，对于天冬氨酸家族氨基酸的高效生产都具有非常重要的意义。

技术实现思路

[0006]基于上述需求，本专利技术的首要目的在于提供高丝氨酸脱氢酶突变体，以使得其催化性能得到提升，有利于微生物发酵生产L
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高丝氨酸等代谢产物。
[0007]本专利技术通过以下技术思路实现，以B.distachyon野生型Hom片段为模板，利用易错PCR随机突变方法获得Hom编码基因突变文库，采用基于Goldengate技术的载体构建策略将其亚克隆至表达载体上，获得含有高丝氨酸脱氢酶Hom突变体编码基因的重组质粒文库。随后将重组质粒文库导入BL21（DE3）感受态细胞中，通过96孔板初筛和试管、摇瓶复筛，最终筛选获得酶活性提高的突变体，其突变位点分别为T186A、N283K、A137T/I188V。
[0008]本专利技术提供一种来源于野生型二穗短柄草（Brachypodiumdistachyon）的高丝氨酸脱氢酶突变体，其特征在于，相对于SEQ ID No.2所示氨基酸序列而言，其特征在于，相对于SEQ ID No.2所示氨基酸序列而言，仅第T186位由苏氨酸T突变为丙氨酸A，或者第283位由天冬酰胺N突变为赖氨酸K中的一个位点突变；仅存在第137位由丙氨酸A突变为苏氨酸T，仅存在于第188位由异亮氨酸I突变为缬氨酸V的组合突变。本专利技术进一步提供所述高丝氨酸脱氢酶突变体的编码基因。优选地实施方式中，所述高丝氨酸脱氢酶Hom编码基因的核苷
酸序列是在SEQ ID No.1所示核苷酸酸序列的基础进行突变获得的。本专利技术还提供含有所述的高丝氨酸脱氢酶Hom突变体编码基因的表达载体和宿主细胞。在一个优选实施方式中，所述表达载体包括但不限于pEC
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K99E，通过构建含有所述Hom突变体编码基因的重组质粒，并将其导入微生物底盘细胞中，用于发酵生产L
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高丝氨酸及下游衍生物等。在具体的实施方式中，所述微生物底盘细胞可选自棒杆菌属、肠杆菌属，优选地是大肠杆菌（Escherichia coli）、谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）。
[0009]本专利技术还提供了高丝氨酸脱氢酶突变体在发酵生产L
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高丝氨酸及衍生物中的应用。选用具有一定L
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高丝氨酸生产能力的底盘工程菌进行应用性能测试，在一个具体的实施例中，所述工程菌Cg
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HSE特征在于谷氨酸棒杆菌Corynebacterium glutamicumATCC 13032中敲除了自身高丝氨酸降解途径基因thrB，同时过表达天冬氨酸激酶基因LysC。
[0010]本专利技术相应提供一种制备L
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高丝氨酸或其衍生物的方法，其特征在于，将含有所述编码基因的重组微生物发酵生产所述L
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高丝氨酸和/或其衍生物，所述微生物以具有L
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高丝氨酸生产能力的底盘工程菌作为出发菌。
[0011]优选地，所述微生物是具有L
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高丝氨酸生产能力的大肠杆菌、谷氨酸棒杆菌，更优选为具有L
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高丝氨酸生产能力的大肠杆菌、谷氨酸棒杆菌。
[0012]进一步优选地，所述谷氨酸棒杆菌中敲除了自身高丝氨酸降解途径基因thrB，同时过表达天冬氨酸激酶LysC；尤其优选地，所述出发谷氨酸棒杆菌是Corynebacterium glutamicumATCC 13032。
[0013]本专利技术有益效果在于，通过对B.distachyon 来源的高丝氨酸脱氢酶编码基因Hom进行突变和筛选，获得了催化活性不同程度提升的高丝氨酸脱氢酶突变体。因此，本专利技术提供的所述高丝氨酸脱氢酶突变体能够为高效发酵生产L
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高丝氨酸及下游其他天冬氨酸家族代谢产物奠定了良好基础，相较于未突变型高丝氨酸脱氢酶具有更好的工业化应用前景。
附图说明
[0014]图1、高丝氨酸脱氢酶BdHSD及其突变体酶活测定。
[0015]图2、表达不同高丝氨酸脱氢酶突变体对高丝氨酸产量的影响。
实施方式
[0016]为使本专利技术的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本专利技术作进一步的详细说明，但并不应理解为对本专利技术的限制。实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为本领域技术人员所熟知的常规方法。下述实施例中所使用的材料、试剂等如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0017]实施例1、高丝氨酸脱氢酶Hom突变体文库的构建二穗短柄草B.distachyon的高丝氨酸脱氢酶Hom基因野生型的编码序列（SEQ ID NO：1）：ATGCCCCCACAGGCTCAAGCAAAATCAGTATTGCCTGTAGTACTACTTGGCTGCGGCGGTGTTGGTCGCCACCTGCTGCGCCACATCGTGTCTTGTCGTCCGCTGCATGCAAATCAGGGCGTGAGCATCCGCGTGGTC本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种来源于二穗短柄草（Brachypodium distachyon）的高丝氨酸脱氢酶Hom突变体，其特征在于，相对于SEQ ID No.2所示氨基酸序列而言，仅第T186位由苏氨酸T突变为丙氨酸A，或者第283位由天冬酰胺N突变为赖氨酸K中的一个位点突变；仅存在第137位由丙氨酸A突变为苏氨酸T和第188位由异亮氨酸I突变为缬氨酸V的组合突变。2.如权利要求1所述高丝氨酸脱氢酶Hom突变体的编码基因。3.如权利要求2所述的编码基因，其特征在于，其核苷酸序列是在SEQ ID No.1所示核苷酸酸序列的基础进行突变获得的。4.含有如权利要求2或3所述编码基因的表达载体。5.含有如权利要求2或3所述编码基因的宿主细胞，优选是大肠杆菌、谷氨酸棒杆菌。6.如权利要求1所述的高丝氨酸脱氢酶Hom突变体或其编码基因在制备L
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高丝氨酸或其衍生物中的应用，所述衍生物选自O
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【专利技术属性】
技术研发人员：刘君，魏亮，徐宁，
申请(专利权)人：中国科学院天津工业生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：