醇脱氢酶突变体及其在生物无机胺化中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种醇脱氢酶突变体及其在生物无机胺化中的应用，所述醇脱氢酶突变体是将SEQ ID No.2所示的醇脱氢酶氨基酸序列中第73位、第107位、第175位、第96位或第286位进行单突变或多突变获得的。本发明专利技术提供的醇脱氢酶突变体能够高效地为氧化还原体系不断提供NADH，保证生物无机胺化过程中的高效辅酶供应，使无机胺化合成成本降低；本发明专利技术的醇脱氢酶突变体对NAD

【技术实现步骤摘要】
醇脱氢酶突变体及其在生物无机胺化中的应用
(一)

[0001]本专利技术涉及生物无机胺化技术，特别涉及一种醇脱氢酶突变体及其在生物无机胺化中的应用。
(二)
技术介绍

[0002]草铵膦，即4
‑
[羟基(甲基)膦酰基]‑
D,L
‑
高丙氨酸(4
‑
[Hydroxy(methyl)phosphono]‑
D,L
‑
homoalanine，PPT)是一类含磷的氨基酸类除草剂，作用的靶目标是谷氨酰胺合成酶，具有活性高、吸收好、杀草谱广、低毒、环境兼容性好等特点。近些年，作为世界第三大非灭生性除草剂及世界第二大转基因作物耐受除草剂，草铵膦表现出巨大的市场潜力，主要的促因是抗草铵膦转基因农作物的大范围推广及其主要竞品(草甘膦与百草枯)市场的萎缩。
[0003]草铵膦的两种构型中，只有L
‑
型具有除草活性，而市售的草铵膦均为其消旋体(Herbicidal compositions[P].Patent application US4265654A，1981)。L
‑
型草铵膦单体的使用，能够显著减少草铵膦的施用量，减轻环境的压力，同时减缓杂草抗性的产生，表现出非常显著的环保优势。
[0004]因此，L
‑
草铵膦制备工艺的开发具有非常重要的意义。手性纯L
‑
草铵膦(L
‑
PPT)的制备方法主要有三种：手性拆分法，化学合成法和生物催化法。生物催化法生产草铵膦则具有立体选择性严格、反应条件温和、收率高等优点，是生产L
‑
草铵膦的优势方法。主要包括以下三类：
[0005]1)以L
‑
草铵膦的衍生物为底物，通过酶法直接水解获得，主要的优点是转化率高，产物e.e.值较高，但需要昂贵且不易获得的手性原料作为前体，成本较高，不利于工业化生产。例如生物法制备L
‑
草铵膦最简单的方法就是利用蛋白酶直接水解双丙氨膦。双丙氨膦是一种天然的三肽化合物，在蛋白酶的催化下，双丙氨膦脱去2分子L
‑
丙氨酸，生成L
‑
草铵膦。
[0006]2)以外消旋草铵膦的前体为底物，通过酶的选择性拆分获得。主要优点为原料相对易得，催化剂活力高，但其理论收率只能达到50％，会造成原料的浪费。
[0007]3)以α
‑
酮酸
‑2‑
羰基
‑4‑
(羟基甲基膦酰基)丁酸(Alpha
‑
ketoacid
‑2‑
carbonyl
‑4‑
(hydroxymethylphosphono)，PPO)为底物，通过酶的不对称合成获得，主要涉及的酶包括转氨酶与草铵膦脱氢酶。Bartsch(Bartsch K(2005)Process for the preparation of 1
‑
phosphinothrcine by enzymatic tr ansamination with aspartate.US Patent no.US6936444B1)等利用PPO为底物，L
‑
天冬氨酸为氨基供体，利用从土壤微生物中筛选分离出来的对PPO和L
‑
天冬氨酸有特异性酶活的转氨酶进行催化，当底物浓度为552mM时，在非常高的温度(80℃)下反应4小时，转化率仍达到52％，时空产率仅为4.5g L
‑
PPT/g(催化剂)/h。进一步，利用转氨酶制备L
‑
草铵膦有两大缺陷，其一是这是一个可逆反应，原料PPO不能完全转化为L
‑
PPT，转化率无法达到100％；其二是要使可逆反应向生成L
‑
PPT的方向进行，需要加入至少2倍以上的L
‑
天冬氨酸作为氨基供体，过量的天冬氨酸给L
‑
PPT的分离带
来了很大的麻烦。
[0008]在诸多草铵膦的酶法合成路线中，酮酸中间体的酮羰基是潜手性官能团，能够通过酶法合成途径构建手性中心，酮酸路线也因原料价廉易得，且可以避免使用剧毒氰化物，而成为适宜L
‑
草铵膦工业化开发生产的路线。
[0009]氨基酸脱氢酶(EC 1.4.1.X，AADH)是一类能将氨基酸可逆的脱氨生成对应酮酸的氨基酸脱氢酶，其反应需要核苷类辅酶(NAD(P)+)的参与，利用溶液中的铵根离子，将酮酸中的羰基脱氧、还原胺化生成对应的氨基酸，被广泛应用于天然与非天然α
‑
氨基酸的合成。根据其底物特异性，可分为谷氨酸脱氢酶、亮氨酸脱氢酶、丙氨酸脱氢酶、缬氨酸脱氢酶等。如果其表现出对草铵膦前体具有较高活力，就可称之为“草铵膦脱氢酶(PPTDH)”。
[0010]醇脱氢酶(EC 1.1.1.1，ADH)是生物催化氧化还原反应的重要辅助酶，用于氧化还原催化反应中辅酶NAD(P)H的再生循环，异丙醇可作为其底物用于辅酶再生，产物丙酮沸点低，易于除去，适用于工业生产。而目前常用的辅助酶
‑
葡萄糖脱氢酶，会有葡萄糖酸等副产物产生，当主产物是酸时，副产物往往很难去除。
[0011]虽然醇脱氢酶在辅酶再生循环系统中表现出巨大潜力，但野生型的醇脱氢酶辅因子亲和力欠佳，酶活仍较低，其应用有局限性，不足以胜任辅因子再生的通用工具酶，因此需要分子改造提高其底物亲和力和酶活。
(三)
技术实现思路

[0012]本专利技术目的是提供一种醇脱氢酶突变体及在生物无机胺化中的应用，所述生物无机胺化方法是利用醇脱氢酶突变体提高生产NADH的效率，优化辅酶再生体系，为生物无机胺化提供更多的能量。本专利技术通过对醇脱氢酶进行定点突变，提供多个酶活显著提高的醇脱氢酶突变体，不仅实现了醇脱氢酶在大肠杆菌中异源表达，还提高了醇脱氢酶生产NADH的效率，优化了辅酶再生体系，这些突变体可以在生物无机胺化反应中保证更高的辅酶供应量，比如提高了L
‑
草铵膦、L
‑
谷氨酸、L
‑
天冬氨酸的产量，具有较强的工业应用价值。
[0013]本专利技术采用的技术方案是：
[0014]本专利技术提供一种醇脱氢酶突变体，所述醇脱氢酶突变体是将SEQ ID No.2所示的醇脱氢酶氨基酸序列中第73位、第107位、第175位、第96位或第286位进行单突变或多突变获得的。
[0015]优选的，所述醇脱氢酶突变体是将SEQ ID No.2所示氨基酸序列突变为下列之一：(1)第73位甘氨酸突变为丙氨酸(G73A)；(2)第73位甘氨酸突变为丙氨酸、第107位谷氨酸突变为丝氨酸(G73A
‑
E107S)；(3)第73位甘氨酸突变为丙氨酸、第107位谷氨酸突变为丝氨酸、第175位甘氨酸突变为天冬氨酸(G73A
‑
E107S
‑
G175D)；(4)第73位甘本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种醇脱氢酶突变体，其特征在于，所述醇脱氢酶突变体是将SEQ ID No.2所示的醇脱氢酶氨基酸序列中第73位、第107位、第175位、第96位或第286位进行单突变或多突变获得的。2.如权利要求1所述的醇脱氢酶突变体，其特征在于，所述醇脱氢酶突变体是将SEQ ID No.2所示氨基酸序列突变为下列之一：(1)第73位甘氨酸突变为丙氨酸；(2)第73位甘氨酸突变为丙氨酸、第107位谷氨酸突变为丝氨酸；(3)第73位甘氨酸突变为丙氨酸、第107位谷氨酸突变为丝氨酸、第175位甘氨酸突变为天冬氨酸；(4)第73位甘氨酸突变为丙氨酸、第107位谷氨酸突变为丝氨酸、第175位甘氨酸突变为天冬氨酸、第96位天冬氨酸突变为甘氨酸；(5)第73位甘氨酸突变为丙氨酸、第107位谷氨酸突变为丝氨酸、第175位甘氨酸突变为天冬氨酸、第96位天冬氨酸突变为甘氨酸、第286位缬氨酸突变为丙氨酸。3.一种含权利要求1所述醇脱氢酶突变体的编码基因的重组基因工程菌。4.一种权利要求1所述醇脱氢酶突变体在生物无机胺化反应中的应用。5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述应用是：以含醇脱氢酶突变体基因和草铵膦脱氢酶基因的共表达重组菌经发酵培养获得的湿菌体为催化剂，以酮酸化合物为底物，加入异丙醇和/或NAD
+
，以pH值为7
‑
8的缓冲液为反应介质构成反应体系，在35℃
‑
60℃、500
‑
600rpm条件下反应，反应完全，将反应液分离纯化，获得对应的手性化合物。6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述反应体系中，催化剂的用量以湿菌体总重量计为5
‑
30g/L，所述底物的初始浓度为10～500mM，NAD添加量为0
‑
5mM，异丙醇添加量为10～500mM。7.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述底物为2
‑
...

【专利技术属性】
技术研发人员：薛亚平，程峰，王成娇，邹树平，徐建妙，郑裕国，
申请(专利权)人：浙江工业大学，
类型：发明
国别省市：