一种酮还原酶突变体及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一种酮还原酶突变体及其应用，该酮还原酶突变体是由SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列发生突变得到的，所述突变至少包括如下突变位点中的一个：第113位由N突变为R或K，第141位由S突变为A、D、E、G或V，第149位由D突变为A或F，第152位由W突变为H、L、M或Y，第197位由A突变为M或F，第207位由S突变为A或T。该酮还原酶突变体可应用于手性醇化合物的绿色化学合成中，催化活性高，稳定性好。与化学合成方法相比，其所催化的反应简单温和，反应选择性高，制备成本低，具有较好的应用前景。具有较好的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种酮还原酶突变体及其应用


[0001]本专利技术涉及生物
，具体地说涉及一种酮还原酶突变体及其应用。

技术介绍

[0002]目前，生物酶化被广泛应用于化学工业中大规模生产药物或其手性中间体。利用生物酶的催化反应具有很多优点，例如，可在良性溶剂中，温和反应条件下进行，具有良好的特异性和选择性。然而，利用生物酶的催化反应也有自身的缺点，包括：在生产反应条件下缺乏稳定性，产物抑制，反应需要在水介质中进行，而许多感兴趣的底物的水溶性差，不能进行有效反应。为了克服上述缺陷，人们对生物酶进行了各种技术修饰，如定向进化、随机突变和蛋白质工程，来克服上述缺点，使得生物酶能高效、环保地用于化学分子的合成，如活性药物成分。
[0003]酮还原酶(KREDs)(EC 1.1.1)是醛酮还原酶的一部分，它催化羰基还原为手性醇。KRED催化前手性酮(羰基)还原为手性醇的例子已经被报道，包括工业规模上的一些应用。孟鲁司特的合成是一个典型的例子，在该药物的合成过程中，人们利用KRED替代现有的和昂贵的化学还原剂(DIP
‑
Cl)。现有技术还报道了在磺培南，阿托伐他汀，瑞舒伐他汀，替格瑞洛等药物合成过程中利用酮还原酶合成手性醇。酮还原酶作为立体选择性还原催化剂在合成活性药物分子或其中间体中的应用越来越广泛。但是酮还原酶对不同非天然底物的催化活性差异很大，例如，同一种酮还原酶对有些非天然羰基底物来说，将其催化还原为手性醇的效果很好，但是对另外一些特定的非天然羰基底物来说，根本没有催化效果，或者催化效果非常差，而且在稳定性及选择性上差异也比较大。因此，对很多羰基底物来说，利用酮还原酶将其还原为手性醇的过程中存在的问题是：现有技术中没有合适的酮还原酶，因为这些酮还原酶大多情况下催化效果不佳，需要寻找合适的酮还原酶，或者通过理性设计提高已知酮还原酶的活性和特异性，促进酮还原酶在手性醇的合成及产业化生产上的应用。

技术实现思路

[0004]为了解决化学合成特定手性醇过程中存在的低效率和低选择性，以及现有酮还原酶催化特定羰基底物还原为手性醇的活性低以及稳定性差的问题，本专利技术一方面的目的是提供一种对特定羰基底物催化活性高、立体选择性好的酮还原酶突变体。为实现本专利技术的目的，本专利技术采用以下技术方案：
[0005]一种酮还原酶突变体，该酮还原酶突变体的氨基酸序列是由SEQ IDNO：1所示的氨基酸序列发生突变得到的氨基酸序列，所述突变至少包括如下突变位点中的一个：第113位由N突变为R或K，第141位由S突变为A、D、E、G或V，第149位由D突变为A或F，第152位由W突变为H、L、M或Y，第197位由A突变为M或F，第207位由S突变为A或T，或者所述酮还原酶突变体的氨基酸序列具有发生突变的氨基酸序列中的突变位点，与发生突变的氨基酸序列具有至少80％以上、或至少85％以上、或至少90％、93％、95％、96％、97％、98％、99％的以上同源性，且与发生突变的氨基酸序列具有相同的功能。
[0006]在本专利技术的一些优选具体实施例中，上述突变至少包括如下突变位点中的一个：第113位由N突变为R(N113R)，第141位由S突变为A(S114A)，第149位由D突变为F(D149F)，第152位由W突变为Y(W152Y)，第197位由A突变为M(A197M)，第207位由S突变为A(S207A)，或者所述酮还原酶突变体的氨基酸序列具有发生突变的氨基酸序列中的突变位点，与发生突变的氨基酸序列具有至少80％以上、或至少85％以上、或至少90％、93％、95％、96％、97％、98％、99％的以上的同源性，且与发生突变的氨基酸序列具有相同的功能。
[0007]在本专利技术的一些更优选具体实施例中，上述突变至少包括第113位由N突变为R，第141位由S突变为A，第149位由D突变为F和第152位由W突变为Y。在本专利技术的一些优选具体实施例中，上述突变至少包括第113位由N突变为R，第141位由S突变为A，第149位由D突变为F，第152位由W突变为Y和第197位由A突变为M。在本专利技术的一些优选具体实施例中，上述突变至少包括第113位由N突变为R，第141位由S突变为A，第149位由D突变为F，第152位由W突变为Y，第197位由A突变为M和第207位由S突变为A，或者所述酮还原酶突变体的氨基酸序列具有发生突变的氨基酸序列中的突变位点，与发生突变的氨基酸序列具有至少80％以上、或至少85％以上、或至少90％、93％、95％、96％、97％、98％、99％的以上的同源性，且与发生突变的氨基酸序列具有相同的功能。
[0008]本专利技术另一方面的目的是提供编码上述酮还原酶突变体的基因。
[0009]在本专利技术的一些优选具体实施例中，上述基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7或SEQ ID NO.8所示序列。
[0010]在本专利技术的一些更优选具体实施例中，上述基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.8所示序列。
[0011]本专利技术再一方面的目的是提供一种重组表达载体，该重组表达载体包含编码上述酮还原酶突变体的基因。
[0012]在本专利技术的一些优选具体实施例中，所述重组表达载体选自pET
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28a、pET
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dute1、pRSF
‑
dute1。在本专利技术的一些更优选具体实施例中，所述重组表达载体选自pET
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28a。
[0013]本专利技术再一方面的目的是提供一种基因工程菌，该基因工程菌用于生产上述酮还原酶突变体，其包含上述重组表达载体。
[0014]在本专利技术的一些优选具体实施例中，上述基因工程菌选自大肠杆菌MG1655、大肠杆菌BL21(DE3)或大肠杆菌BL21(DE3)pLysS。
[0015]在本专利技术的一些更优选具体实施例中，上述基因工程菌选自大肠杆菌BL21(DE3)。
[0016]本专利技术再一方面的目的是提供上述酮还原酶突变体在以羰基化合物为原料制备手性醇化合物中的应用。
[0017]在本专利技术的一些优选具体实施例中，所述羰基化合物的结构式为
[0018]其中，R1和R2各自独立地为C1～C8烷基、C5～C
10
环烷基、
[0019]C5～C
10
芳基、C5～C
10
杂芳基或含胺基、醚、硫醚或酯的基团，或者R1和R2与羰基上的碳共同形成5～10元环，所述5～10元环全部由碳构成，或所述5～10元环中除碳原子之外还有杂原子参与构成5～10元环，所述杂原子选自N、O、S，以及所述5～10元环是未被取代的或是被卤素、氧、硫、羟基、烷氧基或烷基中的至少一个基团所取代，
[0020]所述手性醇化合物的结构式为
[0021]在本专利技术的一些优选具体实施例中，所述羰基化合为式I所示化合物，所述醇类化合物为式II所示化合物，
[0022][0023]本专利技术的上述酮还原酶突变体是在氨基酸序列为SEQ ID NO：1本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种酮还原酶突变体，其特征在于，所述酮还原酶突变体的氨基酸序列是由SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列发生突变得到的氨基酸序列，所述突变至少包括如下突变位点中的一个：第113位由N突变为R或K，第141位由S突变为A、D、E、G或V，第149位由D突变为A或F，第152位由W突变为H、L、M或Y，第197位由A突变为M或F，第207位由S突变为A或T，或者所述酮还原酶突变体的氨基酸序列具有发生突变的氨基酸序列中的突变位点，与发生突变的氨基酸序列具有至少80％以上、或至少85％以上、或至少90％、93％、95％、96％、97％、98％、99％的以上同源性，且与发生突变的氨基酸序列具有相同的功能。2.根据权利要求1所述酮还原酶突变体，其特征在于，所述突变至少包括如下突变位点中的一个：第113位由N突变为R，第141位由S突变为A，第149位由D突变为F，第152位由W突变为Y，第197位由A突变为M，第207位由S突变为A，或者所述酮还原酶突变体的氨基酸序列具有发生突变的氨基酸序列中的突变位点，与发生突变的氨基酸序列具有至少80％以上、或至少85％以上、或至少90％、93％、95％、96％、97％、98％、99％的以上的同源性，且与发生突变的氨基酸序列具有相同的功能。3.根据权利要求2所述的酮还原酶突变体，其特征在于，所述酮还原酶突变体包括下列突变位点：第113位由N突变为R，第141位由S突变为A，第149位由D突变为F，以及第152位由W突变为Y，或者第113位由N突变为R，第141位由S突变为A，第149位由D突变为F，第152位由W突变为Y，以及第197位由A突变为M，或者第113位由N突变为R，第141位由S突变为A，第149位由D突变为F，第152位由W突变为Y，第197位由A突变为M，以及第207位由S突变为A。4.根据权利要求2所述的酮还原酶突变体，其特征在于，所述酮还原酶突变体包括突变位点：第113位由N突变为R，第141位由S突变为A，第149位由D突变为F，第152位由W突变为Y，第197位由A突变为M，以及第207位由S突变为A，或者所述酮还原酶突变体的氨基酸序列具有发生突变的氨基酸序列中的突变位点，与发生突变的氨基酸序列...

【专利技术属性】
技术研发人员：巨晓芝，柳学伟，李娟，李想，吴玉卓，李岩，房杰，王宁波，信铭雁，王国平，
申请(专利权)人：奥锐特药业天津有限公司，
类型：发明
国别省市：