一种转氨酶突变体及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一种转氨酶突变体及其应用，该转氨酶突变体是由SEQID NO：1所示的氨基酸序列发生突变得到的，所述突变至少包括下列突变位点中的一个：第60位由W突变为A、D或K，第89位由F突变为A、D或K，第121位由S突变为A、D或F，第153位由Y突变为A、D或F，第226位由E突变为A、R或F，第261位由V突变为A、D或Y，第380位由Q突变为A、K或F，第417位由A突变为F、D或K。该转氨酶突变体可应用于大位阻手性胺类化合物的绿色化学合成中，催化活性高，稳定性好。与化学合成方法相比，其所催化的反应简单温和，无需氢化反应，反应选择性高，制备成本低，具有较好的应用前景。用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种转氨酶突变体及其应用


[0001]本专利技术涉及生物
，具体地说涉及一种转氨酶突变体及其应用。

技术介绍

[0002]转氨酶催化氨基供体(胺供体)和前手性酮底物之间氨基的立体选择性转移，是生成光学纯手性胺的有效生物催化工具。转氨酶(TAs)可以分为两类：α
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转氨酶(α
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TAs)和ω
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转氨酶(ω
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TAs)，该分类这取决于所转化的底物的类型。α
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TAs要求在酮底物羰基官能团的α
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位置和胺供体上均存在一个羧基。ω
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TAs可以接受脂肪族酮和胺作为底物(即不仅仅是α
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酮酸和氨基酸)。ω
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TAs可进一步分为两个亚组，β
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TAs和胺转氨酶(ATAs)，其中ATAs具有工业价值，因为它们能够使用广泛的胺供体和酮受体进行还原胺化反应。ATAs催化胺供体和酮受体的分子间交换，近年来在药物中间体的生产中受到了相当大的关注。
[0003]虽然转氨酶催化的不对称转氨反应为手性胺化合物的合成提供了一种经济、绿色的合成思路。然而，ATAs在大规模应用中的一些局限性和挑战也已被确定，如底物范围相当窄、不利的热力学反应平衡和底物/产物抑制。一般来说，潜在手性羰基旁边的基团如果比甲基大，转氨酶的催化效果会明显降低。为了克服这一限制，人们已经付出了大量的努力来进化ATAs以改善其底物范围，特别是在所谓的“体积大”化合物。不同的蛋白质工程方法被用于优化可用ATAs。
[0004]CN112980810A公开了一种来源于紫色色杆菌(Chromobaterium violaceum)的转氨酶突变体，旨在使用该转氨酶突变体将潜手性羰基旁边的基团大于甲基的酮类化合物高选择性地转化为手性胺化合物。但该转氨酶突变体的获得需要进行饱和突变及迭代突变，筛选工作量大，操作十分繁琐。

技术实现思路

[0005]为了解决化学合成手性胺过程中存在的低效率和低选择性和高环境影响，以及生物合成过程中生物酶催化活性低以及稳定性差的问题，本专利技术的一方面的目的是提供一种催化活性高、热稳定性好并且可以高效率催化合成大位阻手性胺化合物的转氨酶突变体。为实现本专利技术的目的，本专利技术采用以下技术方案：
[0006]一种转氨酶突变体，该转氨酶突变体的氨基酸序列是由SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列发生突变得到的氨基酸序列，所述突变至少包括下列突变位点中的一个：
[0007]第60位由W突变为A、D或K(W60A/D/K)；第89位由F突变为A、D或K(F89A/D/K)；第121位由S突变为A、D或F(S121A/F/D)；第153位由Y突变为A、D或F(Y153A/D/F)；第226位由E突变为A、R或F(E226A/R/F)；第261位由V突变为A、D或Y(V261A/D/Y)；第380位由Q突变为A、K或F(Q380A/F/K)，第417位由A突变为F、D或K(A417F/D/K)，或者所述转氨酶突变体的氨基酸序列具有发生突变的氨基酸序列中的突变位点，且与发生突变的氨基酸序列具有80％以上同源性的氨基酸序列。
[0008]优选地，上述突变至少包括下列突变位点中的一个：
[0009]第60位由W突变为A(W60A)，第89位由F突变为K(F89K)，第121位由S突变为D(S121D)，第153位由Y突变为A(Y153A)，第226位由E突变为R(E226R)，第261位由V突变为A(V261A)，第380位由Q突变为F(Q380F)，第417位由A突变为F(A417F)，或者所述转氨酶突变体的氨基酸序列具有发生突变的氨基酸序列中的突变位点，且与发生突变的氨基酸序列具有80％以上同源性的氨基酸序列。
[0010]更优选地，上述转氨酶突变体包括下列突变位点：
[0011]第60位由W突变为A，第89位由F突变为K，第121位由S突变为D，第153位由Y突变为A和第226位由E突变为R，或者，
[0012]第60位由W突变为A，第89位由F突变为K，第121位由S突变为D，第153位由Y突变为A，第226位由E突变为R和第261位由V突变为A，或者，
[0013]第60位由W突变为A，第89位由F突变为K，第121位由S突变为D，第153位由Y突变为A，第226位由E突变为R，第261位由V突变为A和第380位由Q突变为F，或者，
[0014]第60位由W突变为A，第89位由F突变为K，第121位由S突变为D，第153位由Y突变为A，第226位由E突变为R，第261位由V突变为A，第380位由Q突变为F和第417位由A突变为F。
[0015]更优选地，上述转氨酶突变体包括突变位点第60位由W突变为A，第89位由F突变为K，第121位由S突变为D，第153位由Y突变为A，第226位由E突变为R，第261位由V突变为A，第380位由Q突变为F和第417位由A突变为F，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
[0016]本专利技术另一方面的目的是提供编码上述转氨酶突变体的基因。
[0017]优选地，上述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，或者上述基因的核苷酸序列为与SEQ ID NO.4所示序列具有95％以上同源性的序列。
[0018]本专利技术再一方面的目的是提供一种重组表达载体，该重组表达载体包含编码上述转氨酶突变体的基因。
[0019]优选地，所述重组表达载体选自pET
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28a、pET
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dute1、pRSF
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dute1，更优选pET
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28a。
[0020]本专利技术再一方面的目的是提供一种基因工程菌，该基因工程菌用于生产上述转氨酶突变体，其包含上述重组表达载体。
[0021]优选地，上述基因工程菌选自大肠杆菌MG1655或大肠杆菌BL21(DE3)或大肠杆菌BL21(DE3)pLysS。
[0022]更优选地，上述基因工程菌选自大肠杆菌BL21(DE3)。
[0023]本专利技术再一方面的目的是提供上述转氨酶突变体在催化羰基类化合物或氨基供体制备手性胺中的应用。
[0024]本专利技术再一方面的目的是一种生产手性胺的方法，该方法包括利用上述转氨酶突变体对酮类化合物或氨基供体进行催化转氨基反应的步骤。
[0025]优选地，上述酮类化合物为其中R1和R2各自独立地为选取代或未被取代的烷基、不饱和烃基、芳烃基或杂环芳烃基；R1和R2可单独或两者互相结合形成取代或未被取代的环。
[0026]所述取代是指被卤素原子、氮原子、硫原子、羟基、硝基、氰基、甲氧基、乙氧基、羧基、羧甲基、羧乙基或亚甲二氧基取代。
[0027]本专利技术再一方面的目的是一种式(II)所示化合物的制备方法，该制备方法包括将式(I)所示化合物利用上述转氨酶突变体催化转化形成式(II)所示化合物的步本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种转氨酶突变体，其特征在于，所述转氨酶突变体的氨基酸序列是由SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列发生突变得到的氨基酸序列，所述突变至少包括下列突变位点中的一个：第60位由W突变为A、D或K，第89位由F突变为A、D或K，第121位由S突变为A、D或F，第153位由Y突变为A、D或F，第226位由E突变为A、R或F，第261位由V突变为A、D或Y，第380位由Q突变为A、K或F，第417位由A突变为F、D或K，或者所述转氨酶突变体的氨基酸序列具有发生突变的氨基酸序列中的突变位点，且与发生突变的氨基酸序列具有80％以上同源性的氨基酸序列。2.根据权利要求1所述转氨酶突变体，其特征在于，所述突变至少包括下列突变位点中的一个：第60位由W突变为A，第89位由F突变为K，第121位由S突变为D，第153位由Y突变为A，第226位由E突变为R，第261位由V突变为A，第380位由Q突变为F，第417位由A突变为F，或者所述转氨酶突变体的氨基酸序列具有发生突变的氨基酸序列中的突变位点，且与发生突变的氨基酸序列具有80％以上同源性的氨基酸序列。3.根据权利要求2所述的转氨酶突变体，其特征在于，所述转氨酶突变体包括下列突变位点：第60位由W突变为A，第89位由F突变为K，第121位由S突变为D，第153位由Y突变为A和第226位由E突变为R，或者第60位由W突变为A，第89位由F突变为K，第121位由S突变为D，第153位由Y突变为A，第226位由E突变为R和第261位由V突变为A，或者第60位由W突变为A，第89位由F突变为K，第121位由S突变为D，第153位由Y突变为A，第226位由E突变为R，第261位由V突变为A和第380位由Q突变为F，或者第60位由W突变为A，第89位由F突变为K，第121位由S突变为D，第153位由Y突变为A，第226位由E突变为R，第261位由V突变为A，第380位由Q突变为F和第417位由A突变为F。4.根据权利要求3所述的转氨酶突变体，其特征在于，所述转氨酶突变体...

【专利技术属性】
技术研发人员：李想，柳学伟，李娟，方武宏，巨晓芝，房杰，郭万成，李岩，李洁萍，唐建军，罗香，
申请(专利权)人：奥锐特药业天津有限公司，
类型：发明
国别省市：