本发明专利技术公开了一种羰基还原酶突变体、重组菌及其应用，涉及生物技术领域。本发明专利技术提供了一种新的羰基还原酶突变体，有效解决了现有技术中二酮转化率低，以及酮选择性差的问题，该羰基还原酶突变体具有催化时间短、底物转化率高，酮选择性好的优势。此外，采用本发明专利技术提供的羰基还原酶突变体参与催化反应时，无需额外加入还原型辅酶反应也能正常进行，真正意义上实现了辅酶的零添加，大大降低了工业化应用的成本。本。本。
【技术实现步骤摘要】
一种羰基还原酶突变体、重组菌及其应用
[0001]本专利技术涉及生物
，具体而言，涉及一种羰基还原酶突变体、重组菌及其应用。
技术介绍
[0002]羰基还原酶属于催化不对称潜手性酮活性的酶的一种，其具有催化二酮化合物的活性。目前，专利公开号为CN111575258A的专利提供了一种短链脱氢酶，该短链脱氢酶在催化脂肪族潜手性二酮(如2,3丁二酮)活性较低，专利公开号为CN109468291B虽然公开了羰基还原酶EbSDR8突变体，然而该突变体存在反应时间过长20
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24h，底物转化率低的问题，酮选择性差的问题，且反应需要额外加入还原型辅酶，工业化应用成本高。
[0003]鉴于此，特提出本专利技术。
技术实现思路
[0004]本专利技术的目的在于提供一种羰基还原酶突变体、重组菌及其应用以解决现有的羰基还原酶存在催化反应时间长，底物转化率低的问题。
[0005]本专利技术是这样实现的：
[0006]第一方面，本专利技术提供了一种羰基还原酶突变体，羰基还原酶突变体的氨基酸序列与参考序列相比，具有如下任意一种突变：
[0007](1)第153位Phe突变为Leu(F153L)；
[0008](2)第207位Met突变为Phe(M207F)；
[0009](3)同时将第153位Phe突变为Leu、第207位Met突变为Phe；参考序列如SEQ ID NO.1所示。
[0010]参考序列(野生型)来源于Caenibius tardaugens NBRC 16725，NCBI序列:WP_244925490.1，其DNA序列如SEQ ID NO.4所示，为经过密码子优化后的DNA序列。专利技术人基于参考序列构建羰基还原酶突变体库，筛选获得了具有高催化活性的羰基还原酶突变体，对突变体进行测序发现与野生型相比，在第153位Phe突变为Leu、第207位Met突变为Phe；双突变使得突变体的酶活提高10倍。菌体终浓度为20g(dcw)/L能将200g/L的底物在12h之内转化率在95％以上，有效解决了现有技术中二酮转化率低，以及酮选择性差的问题，具有催化时间短、底物转化率高、酮选择性好的优势。
[0011]此外，采用本专利技术提供的羰基还原酶突变体参与催化反应时，无需额外加入还原型辅酶反应也能正常进行，真正意义上实现了辅酶的零添加，大大降低了工业化应用的成本。
[0012]基于上述双突变体，专利技术人还构建了相应的羰基还原酶单突变体。与野生型相比，构建的单突变体F153L或M207F也能一定程度上提高羰基还原酶的酶活力，分别提高2倍和3倍，具有强于亲本的催化能力。因此，本专利技术可以利用双酮为底物，通过生物酶的催化反应制备单酮。
[0013]上述单位酶活的定义：在标准的反应条件下，每分钟生成1umol单酮所需要的酶量为一个酶活单位U。
[0014]第二方面，本专利技术还提供了一种核酸分子，其编码上述的羰基还原酶突变体。
[0015]参考序列的第153位Phe突变为Leu的羰基还原酶突变体的核苷酸编码序列如SEQ ID NO.2所示；第153位Phe突变为Leu以及第207位Met突变为Phe的双突变体的核苷酸编码序列如SEQ ID NO.3所示。
[0016]在已知氨基酸序列的基础上，本领域的技术人员根据密码子的简并性可以推得编码上述羰基还原酶突变体的核苷酸序列，并不限于上述的核苷酸序列，本领域的技术人员可以根据需要进行密码子的优化，也均在本专利技术的保护范围之内。
[0017]在此用的术语“核酸分子”是指由天然碱基、糖和糖间(骨架)键连组成的核苷(nucleoside)或核苷酸(nucleotide)单体的序列。该术语也包括含有非天然发生的单体或其部分的修饰过的或取代过的序列。本专利技术的核酸分子可以是脱氧核糖核酸序列(DNA)或核糖核酸序列(RNA)，并可包含天然碱基，包括腺嘌呤、鸟嘌呤、胞核嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶。也可含修饰的碱基。这些修饰的碱基的例子包括含氮和脱氮腺嘌呤、鸟嘌呤、胞核嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶；以及黄嘌呤和次黄嘌呤。
[0018]第三方面，本专利技术还提供了一种表达盒或重组载体，其包括上述的核酸分子。
[0019]在此以其最通常的意思来使用术语“载体”并且包括用于核酸的任何中间媒介物，其能够使所述核酸例如引入原核生物和/或真核生物细胞中，并且在合适的情况下，整合至基因组中。这种类型的载体优选在细胞中复制和/或表达。载体包含质粒、噬菌粒、噬菌体或病毒基因组。如在此所用的术语“质粒”通常涉及染色体外基因材料的构建体，通常是环状DNA双链，其可以独立于染色体DNA而进行复制。
[0020]例如载体选自商业质粒pET
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3a。
[0021]上述表达盒包括：启动子、筛选基因和终止子等常规的基因工程元件。
[0022]第四方面，本专利技术还提供了一种重组菌或重组细胞，其包括：上述的核酸分子或者上述的表达盒或重组载体。
[0023]在本专利技术应用较佳的实施方式中，上述重组菌选自大肠杆菌，例如E.coli BL21(DE3)。
[0024]术语“重组细胞”指的是可以用外源核酸转化或转染的任何细胞。根据本专利技术的术语“重组细胞”包含原核生物(例如，大肠杆菌)或真核生物细胞(例如，哺乳动物细胞，特别是人细胞、酵母细胞和昆虫细胞)。特别优选哺乳动物细胞，如来自人、鼠、仓鼠、猪、山羊或灵长类动物的细胞。细胞可以源自多个组织类型，并且包含初级细胞和细胞系。核酸可以以单拷贝形式或两个或多个拷贝形式存在于宿主细胞中，并且在一个实施方案中，在重组细胞中表达。
[0025]第五方面，本专利技术还提供了一种产生上述羰基还原酶突变体的方法，其包括如下步骤：在适合表达的条件下，培养上述的重组菌或重组细胞，从而表达出羰基还原酶突变体；和/或分离羰基还原酶突变体。
[0026]例如在种子液在10
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45℃，诱导表达12h，离心后弃上清，收集湿菌体。种子液的培养条件是在37℃、培养8
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10h。
[0027]第六方面，本专利技术还提供了一种羰基还原酶突变体或者上述的重组菌或重组细胞
在不对称催化双酮化合物合成突厥酮系列化合物中的应用。
[0028]本专利技术所述的羰基还原酶突变体可以以全细胞形式完成催化，也可以通过细胞破碎的粗酶液或者完全破碎的纯酶进行催化。此外，还可以利用特定的固定化技术将上述酶制备成固定化酶或者固定化细胞形式的酶。
[0029]在本专利技术应用较佳的实施方式中，选择性还原合成突厥酮系列化合物的反应体系中，反应介质为异丙醇或其他氢供体。
[0030]反应中异丙醇即作为溶剂同时也作为氢供体。本专利技术不额外加入还原型辅酶反应也能正常进行，真正意义上实现了辅酶的零添加，大大降低了工业化应用的成本。此外反应中所生成的副产物—丙酮以及剩余的异丙醇的分离较为简单，因此可将剩余的异丙醇与丙酮的生产相结合，纯化后的异丙醇可继续循环使用。总之，投入反应原料的利用本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种羰基还原酶突变体，其特征在于，所述羰基还原酶突变体的氨基酸序列与参考序列相比，具有如下任意一种突变：(1)第153位Phe突变为Leu；(2)第207位Met突变为Phe；(3)同时将第153位Phe突变为Leu、第207位Met突变为Phe；所述参考序列如SEQ ID NO.1所示。2.一种核酸分子，其特征在于，其编码权利要求1所述的羰基还原酶突变体。3.一种表达盒或重组载体，其特征在于，其包括权利要求2所述的核酸分子。4.一种重组菌或重组细胞，其特征在于，其包括：权利要求2所述的核酸分子或者权利要求3所述的表达盒或重组载体。5.根据权利要求4所述的重组菌或重组细胞，其特征在于，所述重组菌选自大肠杆菌。6.一种产生权利要求1所述的羰基还原酶突变体的方法，其特征在于，其包括如下步骤：在适合表达的条件下，培养权利要求4
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5任一项所述的重组菌或重组细胞，从而表达出羰基还原酶突变体；和/或分离所述羰基还原酶突变体。7.如权利要求1所述的羰基还原酶突变体或者权利要求4
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5任一项所述的重组菌或重组细胞在不对称催化双酮化合物合成突厥酮系列化合物中的应用。8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述合成突厥酮系列化合物的反应体系中，反应介质为异丙醇或其...
【专利技术属性】
技术研发人员：黄旺生，胡建良，范宇鹏，陈诗浪，林传明，李志江，朱超，周定干，范亚新，厉金锋，
申请(专利权)人：格林生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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