一种通过聚合物缔合相分离作用沉淀II型胶原蛋白的方法技术

本发明专利技术公开了一种通过聚合物缔合相分离作用沉淀II型胶原蛋白的方法，该方法包括：通过酶解得到II型胶原蛋白酶解液，配制阴离子多糖溶液，并将多糖溶液和酶解液的pH调节至酸性；将多糖溶液加入酶解液中，搅拌均匀；静置，离心取沉淀，冷冻干燥，粉碎，得到II型胶原蛋白粉末。本发明专利技术的阴离子多糖包括果胶、硫酸软骨素、硫酸葡聚糖、海藻酸钠等，分子量相对较小、链长较短，酸性条件下能够与Ⅱ型胶原蛋白缔合形成紧密复合物。本发明专利技术相比于传统的盐析技术，得到的产品胶原蛋白含量显著提高，盐含量降低，水分含量也较低，稳定性好、活性高。本发明专利技术技术方案简便易行、产量高。产量高。产量高。

【技术实现步骤摘要】
一种通过聚合物缔合相分离作用沉淀II型胶原蛋白的方法


[0001]本专利技术属于保健品
，具体涉及到一种通过聚合物缔合相分离作用沉淀II型胶原蛋白的方法。

技术介绍

[0002]II型胶原蛋白是软骨基质的重要组成部分，主要分布于关节软骨、玻璃体、髓核、胚胎角膜和视神经网络膜等组织中。它是由3条相同的α1多肽链组成的具有完整三螺旋结构的大分子，每条α1肽链约含有1000个氨基酸残基，相对分子质量在130kDa左右。由于其特殊的分子结构，II型胶原蛋白被广泛应用于食品、医药和材料等领域。更重要的是，大量研究表明口服非变性的II型胶原蛋白，能够抑制动物和人类的关节炎发生或缓解关节炎症状。
[0003]目前，II型胶原蛋白主要是通过酶法来提取，包括除杂、酶解、盐析等步骤，其中，盐析步骤非常重要，它的作用是将II型胶原蛋白从溶液中沉淀出来，以利于后续冷冻干燥。常用的盐有氯化钠、氯化钾等，它们一方面与溶液中的蛋白质争夺水分子，破坏蛋白质胶体颗粒表面的水膜；另一方面又大量中和蛋白质颗粒上的电荷，从而使水中蛋白质颗粒积聚而沉淀析出。盐析法沉淀蛋白质的优点在于操作简单，可以提高产品的纯度，同时降低产品的含水量以便于后续干燥。然而，盐析法的缺点也很明显，即会引入大量的盐，使得产品的盐含量过高，然而服用产品时较高的盐摄入量也可能会对人体带来其他危害，不符合健康食品的要求。此外，对于盐析法获得的II型胶原蛋白通常还需要通过透析来降低盐含量，这又会导致工作量大大增加，时间和成本的升高。因此，寻找一种既方便又高效的盐析替代方法具有重要意义。
[0004]在过去的几十年里，随着制药和食品工业对新型功能性成分的需求不断增加，人们对蛋白质
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多糖复合物的兴趣越来越大。例如，将蛋白质和多糖一起用于凝胶、泡沫和乳液，以提高凝胶的强度、泡沫和乳液的稳定性；将蛋白质与多糖复合以提高蛋白质的热稳定性或胃肠消化稳定性；利用蛋白质
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多糖相互作用导致的选择性复合现象来分离纯化大豆蛋白中的不同组分。
[0005]中国专利申请一种采用鸡胸软骨提取非变性II型胶原蛋白的方法报道了一种采用鸡胸软骨提取II型胶原蛋白的方法，包括杀菌、粉碎除糖、两次酶解、透析、干燥等步骤，对于两次酶解获得的上清液在透析后直接进行干燥，但由于酶解时加入了大量纯水以及透析后溶液变稀使得体积进一步变大，将导致干燥步骤的难度和工作量大大增加。因此，寻找一种既方便又高效的从酶解液中回收II型胶原蛋白方法是本领域亟需解决的技术瓶颈。
[0006]研究发现，生物聚合物(如蛋白质和多糖)的水溶液混合体系可以通过两种不同的方式实现相分离：一是通过吸引相互作用形成热力学相容的分子间复合凝聚物，即为缔合型相分离，此时两种生物聚合物被浓缩于同一相区，且静电相互作用是最要的结合力；二是通过排斥相互作用形成热力学不相容的两个相区，即分离型相分离，此时每一相分别富含一种生物聚合物。此外，蛋白质和多糖之间的相互作用与二者的结合亲和力、分子电荷密
度、分子构象(如轮廓长度、分子量和柔韧性)、环境条件(pH、混合比和离子强度)等有关。然而，目前尚未发现将多糖用于II型胶原蛋白制备的报道。

技术实现思路

[0007]为了克服现有技术存在的不足，本专利技术的目的是提供一种通过聚合物缔合相分离作用沉淀II型胶原蛋白的方法及其产物。
[0008]本专利技术通过阴离子多糖与II型胶原蛋白发生缔合相分离作用，从溶液或酶解液中回收II型胶原蛋白，可以避免传统盐析法所带来的产品盐含量高以及稳定性较差的问题。
[0009]本专利技术的目的至少通过如下技术方案之一实现。
[0010]本专利技术提供一种通过聚合物缔合相分离作用沉淀II型胶原蛋白的方法，包括如下步骤：
[0011](1)通过酶解得到II型胶原蛋白酶解液，选取分子量相对较小、链长较短的阴离子多糖配制阴离子多糖溶液；
[0012](2)将阴离子多糖溶液和II型胶原蛋白酶解液的pH值均调节至弱酸性，得到酸性的阴离子多糖溶液和酸性的酶解液；
[0013](3)按比例将酸性的阴离子多糖溶液加入酸性的酶解液中，边添加边搅拌均匀；静置一段时间，离心取沉淀，将沉淀冷冻干燥，粉碎。得到II型胶原蛋白粉末。
[0014]进一步地，步骤(1)所述II型胶原蛋白酶解液的提取步骤包括：原料解冻、清洗、杀菌消毒、匀浆、除杂、酶解。
[0015]进一步地，步骤(1)所述II型胶原蛋白酶解液的提取步骤包括：将鸡胸软骨解冻、清洗，按料液比1kg:(3
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7)L(w/v)加入去离子水并匀浆，得到鸡胸软骨匀浆液，加入NaCl(终浓度为0.5
‑
2.0mol/L)搅拌2
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12h以去除软骨中的杂蛋白。然后以5000
‑
8000rpm离心10
‑
20min取沉淀，按料液比1kg:(3
‑
7)L(w/v)加入0.1
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1.0mol/L乙酸水溶液，添加沉淀质量0.1％
‑
2％(w/w)胃蛋白酶。在10
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30℃恒温摇床中连续振荡10
‑
20h后，以5000
‑
8000rpm离心10
‑
20min，收集酶解上清液，获得酶解液。
[0016]进一步地，步骤(1)所述阴离子多糖的分子量相对较小(＜300kDa)、链长较短(＜60nm)，在酸性条件下能够与Ⅱ型胶原蛋白缔合形成紧密复合物。
[0017]优选地，所述阴离子多糖包括果胶、海藻酸钠、硫酸软骨素、硫酸葡聚糖中的一种以上。
[0018]进一步地，步骤(1)中，所述II型胶原蛋白酶解液的浓度为6
‑
10mg/mL，所述阴离子多糖溶液的浓度为1
‑
5mg/mL。
[0019]进一步地，步骤(1)中，所述II型胶原蛋白酶解液的浓度为8mg/mL。
[0020]进一步地，步骤(2)所述pH值均调节至弱酸性为pH值均调节至2.0
‑
5.0。
[0021]进一步地，步骤(3)所述酸性的阴离子多糖溶液与酸性的酶解液的体积比为(0.1
‑
1):1。
[0022]进一步地，步骤(3)所述静置的时间为1
‑
8h。
[0023]进一步地，步骤(3)所述离心的条件为4000
‑
5000rpm，10
‑
20min。
[0024]进一步地，步骤(3)所述离心的时间为15
‑
20min。
[0025]进一步地，步骤(3)所述冷冻干燥的时间为12
‑
24小时。
[0026]本专利技术还提供所述制备方法制得的II型胶原蛋白。
[0027]进一步地，所述II型胶原蛋白的蛋白含量>50.0％，胶原蛋白含量>45.0％，盐含本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种通过聚合物缔合相分离作用沉淀II型胶原蛋白的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)通过酶解得到II型胶原蛋白酶解液，选取阴离子多糖，配成阴离子多糖溶液；(2)将阴离子多糖溶液和II型胶原蛋白酶解液的pH值均调节至酸性，得到酸性的阴离子多糖溶液和酸性的酶解液；(3)将酸性的阴离子多糖溶液加入酸性的酶解液中，边添加边搅拌均匀，静置后离心取沉淀，将沉淀冷冻干燥，粉碎，得到II型胶原蛋白粉末。2.根据权利要求1所述的一种通过聚合物缔合相分离作用沉淀II型胶原蛋白的方法，其特征在于，步骤(1)所述阴离子多糖的分子量＜300kDa，所述阴离子多糖的链长＜60nm。3.根据权利要求1所述的一种通过聚合物缔合相分离作用沉淀II型胶原蛋白的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述阴离子多糖包括果胶、硫酸软骨素、硫酸葡聚糖、海藻酸钠中的一种以上；所述II型胶原蛋白酶解液的浓度为6
‑
10mg/mL，所述阴离子多糖溶液的浓度为1
‑
5mg/mL。4.根据权利要求1所述的一种通过聚合物缔合相分离作用沉淀II型胶原蛋白的方法，其特征在于，步骤(2)所述pH值均调节至酸性为pH值均调节至2.0
‑

【专利技术属性】
技术研发人员：赵谋明，许蓉，郑淋，张思锐，赵翊君，
申请(专利权)人：广东华肽生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：