纳米增效糖基功能化细菌毒素分子印迹膜基片及其制备方法和应用技术

本发明专利技术涉及一种纳米增效糖基功能化细菌毒素分子印迹膜基片及其制备方法和应用。所述纳米增效的细菌毒素分子印迹膜基片，是以糖基功能化细菌毒素分子印迹聚合物作为偶联剂在所述金石英晶体基片表面形成多层相互交替的纳米材料和糖基功能化细菌毒素分子印迹聚合物。其制备方法为：选择能与细菌毒素特异性识别并能够合成相应分子印迹聚合物的糖分子功能单体；制成分子印迹聚合物溶液；将纳米材料和分子印迹聚合物修饰到金石英晶体基片表面。将按本发明专利技术方法制得的分子印迹膜基片连接到压电石英晶体微天平，可对环境样品提取液中的细菌毒素进行检测。本发明专利技术操作简单，对细菌毒素检测具有高特异性、高灵敏度。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种纳米增效糖基功能化细菌毒素分子印迹膜基片及其制备方法和应用，属于分析化学

技术介绍
许多细菌病原体合成的细菌毒素是致病的首要因素。这种产生细菌毒素的能力是许多细菌病原体致病的潜在机制。细菌毒素主要有三种外毒素、内毒素和非蛋白毒素。外毒素是一种典型的水溶性蛋白，是细菌在指数生长期分泌的已知可感染人类毒性最强的细菌毒素，在很低浓度时就具有很高的毒性。其中霍乱毒素的致病机理是通过找到作为细胞识别物-G蛋白，然后把一个ADP分子结合上去。这就把G蛋白转换到一种持续激活的状态，使其发出一个无休止的信号，使得细胞被这些信号迷惑，在进行其他生命活动的同时，开始将大量的水分子和钠离子运输到细胞外，超过了肠道的再吸收能力而导致危及生命的脱水症状。志贺毒素具有神经毒素、细胞毒素和肠毒素三种生物活性，神经毒性作用于中枢神经系统，引起四肢麻痹、死亡；细胞毒性对人肝细胞、猴肾细胞和HeLa细胞均有毒性；肠毒性具有类似大肠杆菌、霍乱弧菌肠毒素的活性，可以解释疾病早期出现的水样腹泻。大多数毒素是多价态的，它可与宿主细胞膜上特殊的糖蛋白受体结合，作为初始识别与结合位点。通过研究细菌毒素的性质及其侵入宿主细胞的机制，发现糖类化合物在这种作用中发挥着主要作用，其与细菌毒素的相互作用并不是简单的单体结合，而是寡或多糖作用机制，因此采用糖类结构的受体分子检测病原体是非常有利的。但是，许多其他的内源性和外源性蛋白也能识别到糖类碳水化合物，从而导致假阳性结果，因此，单纯依赖糖类化合物与细菌毒素的结合机制检测病毒，其选择性还不能满足实际需要，还需其他特异性识别手段作为辅助。分子印迹合成是在材料中特定识别位点的模板诱导合成技术，通过自组装方式由模板指导分子结构的定位。材料本身可能是低聚物(如DNA复制过程)、多聚体(有 机分子印迹化合物，无机印迹硅胶)或具有二维结构的聚合物(表面接枝单层膜)。在 分子印迹技术中，以模板分子作为模板，单体通过相互作用并交联在其周围，共聚形 成核壳结构聚合物。此时单体和模板通过共价或非共价作用形成一个主客体复合物， 当采用适当方法洗去模板分子之后，高分子聚合物就留下一个与印迹分子空间结构完 全匹配，并含有能与印迹分子专一结合的三维空穴。聚合物上留下分子印迹使其可以 选择性地重新吸附模板分子，从而使分子印迹聚合物拥有生物受体的两个重要特征一 一识别和吸附特异靶分子的能力。二十世纪分子印迹已经取得长足的发展。分子印迹 聚合物(MIP)已成功应用于生物医药、食品、环境监测，以及通过亲和固相提取进 行样品制备等领域。由于MIP与抗体和酶等生物分子受体相比具有高稳定性和低成本 的特点，因此，还可以在化学传感器和生物传感器中作为识别分子，而且当天然受体 不存在或难以得到时，还可以对MIP复合物进行有针对性的修饰。近年来，MIP在细菌毒素、糖类以及蛋白质印迹方面的研究明显增加。利用高效 液相色谱对比印迹和非印迹聚合物分子的分离能力的实验，可以证实分子印迹聚合物 对生物分子的选择性识别作用。Ratner用射频辉光放电等离子沉积法制备了聚合物薄 膜修饰的包覆有二聚糖的蛋白质。二聚糖与高分子膜共价相连，形成一个类似多糖的 空穴，对多种蛋白质包括清蛋白，免疫球蛋白，溶解酵素，核糖核酸酶和链锁状球菌 具有很高的选择性识别能力。但是这种制备方法很难直接应用于大多数传感器的金基 片表面。因此，开发一种快速、 一步检测细菌毒素的检测系统显得越来越重要。
技术实现思路
为解决现有技术中存在的问题，本专利技术提供了一种纳米增效糖基功能化细菌毒素 分子印迹膜基片及其制备方法和应用，可大大提高检测细菌毒素的灵敏度和选择性。本专利技术是通过以下技术方案实现的本专利技术所述的纳米增效糖基功能化细菌毒素分子印迹膜基片，包括金石英晶体基 片，其特殊之处在于以糖基功能化细菌毒素分子印迹聚合物作为偶联剂在所述金石 英晶体基片表面形成多层相互交替的纳米材料和糖基功能化细菌毒素分子印迹聚合 物；所述糖基功能化细菌毒素分子印迹聚合物是将细菌毒素模板分子、糖分子功能单体、交联剂、致孔剂、引发剂和有机溶剂按摩尔比为o.i 2 : 2.5 : o.i 5 : 40 80 : o.oi o.io : i.o i5的比例聚合而成；所述纳米材料为纳米金、碳纳米管或纳米钼。所述糖分子功能单体为A-D-吡喃糖基甘露糖、N-乙酰糖胺、N-乙酰乳糖胺、唾液 酸神经节苷脂或神经酰胺三已糖苷；所述交联剂为三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯、N， N-亚甲基二丙烯酰胺、N， N-l， 4-亚苯基二丙烯酰胺、3， 5-二 (丙烯酰胺)苯甲酸、 乙二醇二甲基丙烯酸酯、二乙烯基苯、N， O-二丙烯酰-L-苯丙胺醇、季戊四醇三丙烯 酸酯或季戊四醇四丙烯酸酯；所述引发剂为偶氮二异丁腈；所述致孔剂为二氯甲烷、 氯仿、乙腈、甲醇、异丙醇、四氯化碳、N,N-二甲基酰胺或二甲基亚砜；所述有机溶 剂为二氯甲垸或四氯化碳。上述细菌毒素分子印迹膜基片的制备方法，包括以下步骤(1) 选择能与细菌毒素特异性识别并能够合成相应分子印迹聚合物的糖分子功能单 体；(2) 将细菌毒素模板分子、糖分子功能单体、交联剂、致孔剂、引发剂和有机溶剂按摩尔比=0.1 2 : 2.5: o.i 5: 40 80 : o.oi o.io : i.o i5混合均匀制成分子印迹聚合物溶液；(3) 将纳米材料按照现有方法制备成纳米材料溶液；(4) 利用基片表面修饰技术，将纳米材料和分子印迹聚合物修饰到金石英晶体基片表 面。步骤(4)中将纳米材料和分子印迹聚合物修饰到金石英晶体基片表面，具体包括 以下步骤(1) 将金石英晶体基片用去离子水清洗，再用纯甲醇浸泡l小时，然后用去离子水冲洗3遍，再用超声波清洗3min，晾干；(2) 将制备的纳米材料溶液超声处理20-60min,得到分散的纳米溶液；(3) 将金石英晶体基片表面浸泡于分散的纳米溶液中5-10min，取出晾干；(4) 将晾干的金石英品体基片表面再浸泡于分子印迹聚合物溶液中5-10min取出，用洗脱剂洗脱20-30min，再于室温下干燥5-10min; (5)重复步骤(3)、 (4)过程4-7次，制得所述分子印迹膜基片。上述的分子印迹膜基片的制备方法，还包括以下步骤将制得的分子印迹膜基片 浸入pH6.8-7.5的缓冲液，保存在4'C冰箱，12-24h后使用。所述洗脱剂为乙腈、水、甲醇-乙酸或乙腈-乙酸。所述缓冲液为柠檬酸-磷酸溶液。本专利技术所述的细菌毒素的检测方法，包括以下步骤将按上述任意一种方法制得 的分子印迹膜基片连接到压电石英晶体微天平，对环境样品提取液中的细菌毒素进行 检测。利用分子印迹膜基片对细菌毒素进行检测的工作原理当有物质在石英晶片上吸 附或沉淀时，晶体震荡频率发生变化(AF)，它与晶片上沉积物的质量变化(AM) 间有简单的线性关系。压电石英晶体微天平的金石英晶体基片共振频率的变化AF与 吸附物质量m的关系如下A F=—2F02( P q u q)— l/2m/A其中Fo为石英基本振动频率，Pq为石英的密度二2.65Xl()Skg/m3， H q为剪切 模量二2.95X10，a， A为基片表面积。本专利技术中使用的是At-cut基片，石英基本振动频率Ftp9MHz，基片表面积A本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种纳米增效的糖基功能化细菌毒素分子印迹膜基片，包括金石英晶体基片，其特征在于：以糖基功能化细菌毒素分子印迹聚合物作为偶联剂在所述金石英晶体基片表面形成多层相互交替的纳米材料和糖基功能化细菌毒素分子印迹聚合物；　　所述糖基功能化细菌毒素分子印迹聚合物是将细菌毒素模板分子、糖分子功能单体、交联剂、致孔剂、引发剂和有机溶剂按摩尔比为０．１～２∶２．５∶０．１～５∶４０～８０∶０．０１～０．１０∶１．０～１５的比例聚合而成；　　所述纳米材料为纳米金、碳纳米管或纳米铂。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：黄加栋，汪世华，裴梅山，于京华，葛慎光，张秀明，邢宪荣，贺晓蕊，林青，朱晗，孙纳新，宋晓妍，袁靓，
申请(专利权)人：济南大学，
类型：发明
国别省市：88[中国|济南]