本发明专利技术涉及一种检测土壤中芳基硫酸酯酶活性的分析方法：１）分别称取土样置于２ｎ个三角瓶中，向三角瓶中加入４ｍｌ缓冲溶液，向第一组ｎ个三角瓶中加入１ｍｌ底物对硝基苯硫酸钾溶液，第二组ｎ个三角瓶作为对照组，摇匀，盖好瓶塞后恒温培养；２）培养结束后，向三角瓶中加入４ｍｌ碱性三羟基氨基甲烷溶液和１ｍｌ氯化钙溶液终止反应并显色，并向第二组对照组加入１ｍｌ底物溶液，混匀，过滤；３）在４１０ｎｍ处比色测定滤液的吸光度值Ａ；４）根据标准曲线计算对硝基苯酚含量，进而计算芳基硫酸酯酶酶活性。本发明专利技术简化了操作步骤，减少了实验过程中的不确定性；减少对设备要求的依赖性；方法准确度高，易操作；结果稳定可靠，重现性好。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及土壤中芳基硫酸酯酶活性的测定，具体地说是一种检测土壤 中芳基硫酸酯酶活性的分析方法。
技术介绍
土壤中的芳基硫酸酯酶能将在土壤硫代谢过程中形成的有机硫酸酯酯 水解成硫酸盐，参与有机硫的释硫过程，成为可被微生物和作物利用的有效态。在pH4 — 9的土壤中均有芳基硫酸酯酶，多以积累态存在。芳基硫酸酯酶可水解对硝基苯磷酸盐，通过比色法测定反应后释放的对 硝基苯酚的含量，来估算芳基硫酸酯酶的活性。R-P-S03- + H20芳基硫酸酯酉l R—OH + H++ SO, 土壤中芳基硫酸酯酶活性的强弱影响到土壤硫代谢过程中硫素营养的 大小，间接影响硫肥的利用效率。土壤芳基硫酸酯酶对土壤硫素的有效性 具有重要作用，可以表征土壤有机硫酸酯的转化方向和强度。土壤中芳基 硫酸酯酶的活性受土壤条件如水分、温度、土壤质地等的强烈影响，同时 也受农田耕作制度、管理措施以及不同作物的影响。因此，对土壤中芳基 硫酸酯酶活性的检验具有重要的意义。目前有关芳基硫酸酯酶活性的测定 虽然已经形成一个相对可靠的方法，但仍然具有一定的缺陷，造成不同土 壤类型测定的差异性，以及不同培养批次的差异性和不确定性，难以定性 比较和定量研究土壤中芳基硫酸酯酶活性，降低了实验效率。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种土壤中芳基硫酸酯酶活性的检测方法。在 借鉴其它酶测定方法原理的基础上，本专利技术方法根据芳基硫酸酯酶的特性， 对其测定歩骤和显色方法进行改进。该方法减少了试验步骤的不稳定性， 使分析结果更加精确可靠，分析重现性更好。为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案为 ，1) 分别称取lg-2g鲜土样品2n份分别置于2n个三角瓶中，论3，一分成 二组，每组n个，向2n个三角瓶中加入4 -8 mL pH=5.75-5.85乙酸缓冲溶 液，向第一组n个三角瓶中加入1 -2 mL 25-50 m moL. L"的底物对硝基苯 硫酸钾工作液，第二组n个三角瓶作底物试剂对照，混匀，盖好瓶塞，放 在36.5"C-37.5。C恒温培养中恒温培养1-2 h;2) 培养结束后，加入4-8mL 0.49-0.51 moL.L-'碱性三THAM (羟基 氨基甲烷)溶液和1 - 2mL 0.49-0.51 moL. L"氯化钙溶液，并向第二组三角 瓶中加入1 -2 mL 25-50 m moL L"的底物对硝基苯硫酸钾工作液，混匀，过滤；所述的碱性THAM溶液是用来终止酶促反应并加以显色，抑制对硝基 苯硫酸酯到对硝基苯酚和硫酸根的反应，且不会产生强碱对土壤有机质的 分解作用而对产物测定产生颜色干扰，同时避免测定过程中产生碳酸钙沉、)*而具；M向、)则*i刍壬n 〉你7T伤，A1_ I I IJ 'JiX "|%| i;/、'J /4_ U J 'l;。、 A(^ 。 H I pn H乂 IJ o3)用分光光度法于410 nm处分别测定上述所得三角瓶中溶液的吸光度A;以对硝基苯酚溶液标准溶液，以对硝基苯酚溶液的系列浓度和其分别用分光光度法在410nm测定的吸光值A，制作工作标准曲线，得到斜率b;根据吸光值A和斜率b，计算所测定滤液中对硝基苯酚的浓度S， S=A*b;计算样品中对硝基苯酚含量mn4)计算磷酸单酯酶酶活性计算公式为:w二m" (m2 x K) =S吗C6H5N03 .g-1干土. h"式中W:单位土壤单位时间内对硝基苯船的产生量；m1:测试溶液中 对硝基苯酚的质量，样品测定吸光值折换的产物质量值；m2:鲜土样品质 量；k:水分系数，烘干土的重量/鲜土重。用分光光度计于410nm处测定吸光度A时，先观察待测液颜色，当步 骤3)中所述的待测液颜色明显超过制作标准曲线最高浓度时的颜色，表明 其中对硝基苯酚含量过高，则用原缓冲溶液稀释5-10倍后再进行比色，若 颜色还是过深，则重复上述稀释过程；最终再用分光光度法于410nm处测 定溶液的吸光度A。所述制作工作标准曲线过程为，称取IOOO mg对硝基苯酚溶解于l L 蒸馏水中，制备1 mg mL—1标准贮备液；吸取标准贮备液1 mL，定容到100 mL，此为0.01mg.mL"对硝基苯酚的溶液；再分别吸取该液0、 1、 2、 3、 4、 5 mL于试管中，用蒸馏水分别补足到相同体积5 mL，加入4 mL 0.1 moL'L"碱性三羟基氨基甲烷溶液和lmL0.5moL.L"氯化钙溶液，显色、 混匀，过滤到比色试管中，与样品一起在410nm测定吸光度A，； 此标准 系列含对硝基苯酚的浓度分别为0、 1、 2， 3、 4禾Q 5 |ig 'mL"(量为0， 10， 20， 30、 40和50吗)。以对硝基苯酚溶液的系列浓度和测定的吸光值A'制 作工作标准曲线，得到斜率b。 本专利技术方法改进的依据土壤中的芳基硫酸酯酶是参与土壤中有机硫酸酯脱硫到生成硫酸根过 程的一切酶的总称，在测定过程中分解底物对硝基苯硫酸钾生成对硝基苯 酚，需要加入氢氧化钠和氯化钙终止反应并显色。 一定浓度的氢氧化钠加 入土壤溶液中会造成土壤有机质分解，生成产物呈褐色，在一定程度上影 响比色结果。本试验中添加碱性三羟基氨基甲垸溶液即可避免土壤有机质 分解，减少颜色干扰；同时避免碳酸钙沉淀的生成影响测定的准确与稳定。本专利技术所使用的测定原理为土壤中的芳基硫酸酯酶与对硝基苯硫酸酯反应，释放对硝基苯酚，通过 测定单位时间内生成产物的含量，来估计土壤芳基硫酸酯酶的活性。因此， 本试验拟通过反应后对硝基苯酚C6H5N03的生成量来表征土壤芳基硫酸酯 酶活性。与其它酶的分析方法相比较，本专利技术的优点主要有1) 所需设备简单、降低了试验成本。本专利技术中的培养试验是在50 mL的三角瓶中进行。2) 所使用的方法显色简单，提高了样品测定的准确度。3) 操作简单，减少操作过程的复杂性；分析结果稳定可靠，重现性好。该酶的其它测定方法中需要设置灭菌土壤作为对照，本方法只需要不加底 物的样品对照。同时，由于本专利技术所涉及到的显色步骤减少了土壤有机质 碱解形成的颜色对测定结果的影响而导致不确定性，故分析结果重现性非 常良好。 具体实施例方式试剂配制1) 对硝基苯硫酸钾溶液(0.05 mol'L—1):称取0.9303 g六水对硝基苯 硫酸钾两份分别溶于40 mL乙酸缓冲溶液，然后用同一种缓冲溶液稀释至 50mL，低温!亡存备用。2) 乙酸缓冲溶液(pH5.8):称取68 g三水乙酸钠溶于700 mL水中， 然后加入1.70mL的冰乙酸(99%)，用水稀释到1L，备用。3) 0.5 mol L—"CaCl2溶液称取73.5 g CaCl2. 2H20溶解于700 mL水 中，用水定容到1 L。4) THAM碱性溶液(0.1 mol丄人pH 12):溶解12.2 g三羟甲基氨基 甲烷(THAM)于800 mL蒸馏水中，用0.5 mol L—1的NaOH调节pH至 12.0，用蒸馏水定容到lOOOmL。5) 对硝基苯酚标准溶液溶解1.000 g对硝基苯酚于700 mL水中， 稀释至1L，放于4^冰箱低温保存，保存时间不宜过长，以不超过数周为操作步骤1) 分别称取1.2 g鲜土样品12份分别置入12个50mL三角瓶中，向 12个三角瓶中加入4 ml缓冲溶液作试剂，向第一组6个本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种检测土壤中芳基硫酸酯酶活性的分析方法，其特征在于： １）分别称取１ｇ－２ｇ鲜土样品２ｎ份分别置于２ｎ个三角瓶中，ｎ≥３，分成二组，每组ｎ个，向２ｎ个三角瓶中加入４－８ｍＬ ｐＨ＝５．７５－５．８５乙酸缓冲溶液，向第一组ｎ个三角瓶中加入 １－２ｍＬ ２５－５０ｍ ｍｏＬ.Ｌ↑［－１］的底物对硝基苯硫酸钾工作液，第二组ｎ个三角瓶作底物试剂对照，混匀，盖好瓶塞，放在３６．５－３７．５℃恒温培养中恒温培养１－２ｈ； ２）培养结束后，加入４－８ｍＬ ０．４９－０．５１ｍｏＬ.Ｌ↑ ［－１］碱性ＴＨＡＭ（三羟基氨基甲烷）溶液和１－２ｍＬ ０．４９－０．５１ｍｏＬ.Ｌ↑［－１］氯化钙溶液，并向第二组三角瓶中加入１－２ｍＬ ２５－５０ｍ ｍｏＬ.Ｌ↑［－１］的底物对硝基苯硫酸钾工作液，混匀，过滤； ３）用分光光度法于４１ ０ｎｍ处分别测定上述所得三角瓶中溶液的吸光度Ａ； 以对硝基苯酚溶液标准溶液，以对硝基苯酚溶液的系列浓度和其分别用分光光度法在４１０ｎｍ测定的吸光值Ａ’制作工作标准曲线，得到斜率ｂ； 根据吸光值Ａ和斜率ｂ，计算所测定滤液中对硝基苯 酚的浓度Ｓ，Ｓ＝Ａ＊ｂ；计算样品中对硝基苯酚含量ｍ↓［１］； ４）计算磷酸单酯酶酶活性： 计算公式为：ｗ＝ｍ↓［１］／（ｍ↓［２］×Ｋ）＝Ｓμｇ Ｃ↓［６］Ｈ↓［５］ＮＯ↓［３］.ｇ↑［－１］干土.ｈ↑［－１］ 式中：ｗ：单位 土壤单位时间内对硝基苯酚的产生量；ｍ↓［１］：测试溶液中对硝基苯酚的质量，样品测定吸光值折换的产物质量值；ｍ↓［２］：鲜土样品质量；ｋ：水分系数，单位重量的烘干土重／鲜土重。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：张玉兰，陈利军，武志杰，陈振华，
申请(专利权)人：中国科学院沈阳应用生态研究所，
类型：发明
国别省市：89[中国|沈阳]
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