包含SARS-CoV-2受体结合结构域的融合蛋白制造技术

一种融合蛋白，包含SARS

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】包含SARS
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CoV
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2受体结合结构域的融合蛋白


[0001]本申请涉及COVID
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19诊断或治疗的医学领域，并且特别是涉及包含严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS
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CoV
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2)受体结合结构域(RBD)或其片段的融合蛋白。所述融合蛋白可用于开发能够筛选抑制病毒刺突(S)蛋白与血管紧张素转化酶2(ACE2)结合的试剂的测定。
[0002]背景
[0003]SARS
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CoV
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2是一种来自冠状病毒科(Coronaviridae)的包膜RNA病毒(Gorbalenya,A.E等人,2020,Nature Microbiology,5(4):p.536
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544)，具有若干种结构组分，包括刺突(S)、包膜(E)、膜(M)和核衣壳(N)蛋白(Lu,R.等人,2020,Lancet 395(10224):p.565
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574)。S蛋白由两个亚基(S1和S2)组成，它们在病毒膜上形成三聚体；S1包含负责与ACE2宿主细胞受体结合的RBD(Hoffmann,M.等人,2020,Cell,181(2):p.271
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280.e8)，而S2使宿主和病毒膜之间的融合成为可能(Lan,J.,等人,2020,Nature,581(7807):215
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220；Wrapp,D.,等人,2020,Science,367(6483):p.1260
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1263)。
[0004]SARS
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CoV
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2已经造成了广泛的COVID
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19大流行，感染了全球数百万人，并且夺去了数十万人的生命。目前，主要和最准确的诊断方法是通过鼻咽拭子的PCR测试(Peng等人,2020,J Med Virol.24；10.1002/jmv.25936)；然而，迫切需要开发能够不论临床症状如何而识别所有受感染的个体的可靠、高度灵敏和特异性的抗体测试。这一信息将对于建立社区监测和实施遏制病毒传播的政策至关重要。
[0005]美国食品药品监督管理局(FDA)已经批准了市场上多种免疫测定测试的紧急使用授权(EUA)，但这些测定都没有得到充分验证。由于缺乏有效的免疫测定(是理解风险、流行病学因素、发病机理和死亡率的关键)，本专利技术人开发了包含RBD分子设计的融合蛋白，旨在作为SARS
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CoV
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2免疫测定中的试剂。
[0006]刺突RBD代表用于检测旨在鉴定当前和过去的感染的抗SARS
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CoV
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2IgG的有前途的抗原；并且因为RBD在其他SARS
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CoV和致病性人类冠状病毒之间保守性很差，所以它显示出识别总抗SARS
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CoV
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2Ig和IgM的增强能力(Premkumar,L.等人,2020,Science Immunology,(10):p1126
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1140)。由于RBD蛋白的小尺寸而导致的测定灵敏度较低的担忧可以通过RBD和N蛋白的分子融合来克服。本专利技术的目的是改进测定特异性(RBD截短物和RBD突变物)和灵敏度(RBD
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N融合物，RBD
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多聚化结构域；RBD
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辣根过氧化物酶(HRP))。
[0007]本专利技术的专利技术人开发了RBD融合蛋白和分子设计，其有助于鉴定将用作治疗剂或用于治疗剂开发的超免疫人类血清。针对RBD开发的大部分抗体显示出中和特性，其基本原理是这些mAb破坏了S蛋白和hACE2蛋白之间的相互作用，阻止了病毒的进入。截至2020年6月29日，FDA尚未批准康复期血浆疗法，但在调查研究和临床试验中，建议在人类被动免疫研究中使用至少1:160的滴度。因为RBD引发了对具有抗病毒活性的抗体的开发，所以这些蛋白对于开发鉴定针对SARS
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CoV
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2的中和抗体的抑制性测定将是必不可少的。
[0008]本专利技术描述了一种用于产生RBD融合蛋白的新的物质组合物。本专利技术体现了用于产生RBD融合蛋白的方法以及编码RBD的核酸分子、其表达载体和宿主细胞。本专利技术还包括
RBD截短物、多聚化结构域和与N蛋白的融合物。这种新的物质组合物还体现了通过分子动力学模拟和亲和力成熟鉴定出的突变，这些突变被描述为表达的增强因素或与ACE2的亲和力的增强因素。所描述的分子设计可用作抗体滴度、抑制剂/中和筛选测定、疫苗开发中的关键试剂，或用作引发产生具有抗病毒活性的治疗性抗体的试剂。这些融合蛋白也可以与HRP融合，用于实现SARS
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CoV
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2检测和定量。
[0009]本专利技术人开发了包含IgG1、IgG2aFc和p53二聚化和四聚化结构域的并非显而易见的RBD分子设计，目标是增加测定亲合力和灵敏度；同时也生产高质量、良好表征和可再现的材料。此外，设计了RBD与N蛋白融合在一起的实施方案，以及RBD和HRP融合在一起的实施方案，目标是提高感染急性期期间的测定灵敏度，因为N蛋白在感染早期被检测到。
[0010]所述分子被抗SARS
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2S/S1/RBD多克隆兔抗体特异性识别，并且可用作免疫测定平台中捕获抗SARS
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2总IgG或IgM抗体的单独实体。当开发完整测定时，这些分子可以固定在固体支持物中，诸如微量滴定板、膜、珠、多肽芯片或层析柱。所展示的设计的子集经过实验测试，具有与其他商业对应物相似或更好的性能(以对hACE2的亲和力来衡量)。
[0011]最后，由于RBD特异性抗体的强抗病毒活性，本文描述的RBD蛋白可用作疫苗候选物以引发广泛有效的抗SARS
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2抗体(Robbiani,D.等人,2020,Nature,doi:https://doi.org/10.1101/2020.05.13.092619；Huo,J.等人,2020,Cell Host&Microbe,(28):p1
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10)。
[0012]概述
[0013]在第一方面，本专利技术涉及一种融合蛋白，包含SARS
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2刺突蛋白的SARS
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2受体结合结构域(RBD)或其片段和N
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末端信号肽，以及多组氨酸标签、接头、寡聚化标签、刺突蛋白中RBD外的区域、辣根过氧化物酶结合结构域或蛋白酶裂解位点中的至少一种。
[0014]在一种实施方案中，所述N
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末端信号肽选自SARS
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CoV
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2刺突本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】NO:57具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。16.根据前述权利要求中任一项所述的融合蛋白，其中所述SARS
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CoV
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2RBD蛋白包含以下一个或更多个位置的突变：G404、A475、T478、N481、G485、F490、Q493、G496、Q498、N501或V503。17.一种细胞，包含根...

【专利技术属性】
技术研发人员：伊丽莎白，
申请(专利权)人：盖立复诊断解决方案公司，
类型：发明
国别省市：