用于体外渗透实验的离体皮肤的保存方法技术

本发明专利技术涉及了皮肤冻存，具体涉及用于体外渗透实验的离体皮肤的保存方法，其中用于体外渗透实验的离体皮肤的低温储存介质，其主要由二甲亚砜或甘油、DMEM高糖培养基组成，其中二甲亚砜和甘油为冷冻保护剂，它们总占比为5％

【技术实现步骤摘要】
用于体外渗透实验的离体皮肤的保存方法


[0001]本专利技术属于生物材料低温保存
，具体涉及以二甲亚砜或甘油为冷冻保护剂，DMEM高糖培养基为基础液的离体皮肤低温储存介质及皮肤保存方法。

技术介绍

[0002]经皮给药系统是指以皮肤为给药途径，药物递送进入人体血液循环，发挥全身治疗作用。经皮给药作为继口服给药和注射给药后的第三大给药系统，其独特的优势在于避免了口服给药的胃肠道降解作用和肝脏首过效应，降低了不良反应的发生率，提高了患者用药的顺应性。
[0003]在经皮给药系统的产品研发和科学研究过程中，制剂中药物经皮渗透性的评价是成功的关键一环。在经皮给药制剂开发中，常以临床试验结果作为制剂优劣的评价标准，然而新药研发、仿制药研发过程中面临着临床试验成本过高以及伦理的问题，因此体外渗透实验因其较低的成本和较好的体内体外相关性被广泛用于经皮给药系统的体外评价。体外渗透实验主要是采用人或动物的离体皮肤及合适的分析方法，动态监测给药后特定时间内透过皮肤的药物量和渗透速率，从而考察药物及其制剂的体外经皮渗透行为，它是制剂处方工艺筛选和优化过程中主要的评判标准，是仿制制剂与参比制剂的一致性评价中的主要手段。
[0004]当前用于体外渗透实验的离体动物皮肤常用的储存方法是：皮肤制备完成后，用纯水或生理盐水冲洗干净后直接冷冻于低温或超低温冰箱中，即
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20℃和
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80℃，实验前取出解冻，使用前使用生理盐水冲洗。而这种没有冷冻保护的保存方法会导致皮肤的活力因低温冷冻而受到严重破坏，因此用于体外评价时，往往已经是“死亡”的皮肤，从而影响经皮给药系统体外渗透性评价的准确性。目前为止，少有针对经皮给药用皮肤模型体外保存及质量变化的系统研究，所以怎么筛选合适的离体皮肤保存方法是一个技术难题。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是维持用于体外渗透实验的离体皮肤的活力和通透性。因此，本专利技术提供了一种以二甲亚砜或甘油为冷冻保护剂的低温储存介质。
[0006]一种离体皮肤低温储存介质，其特征在于：含有冷冻保护剂和DMEM高糖培养基。其中冷冻保护剂占5％
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20％，DMEM高糖培养基占80％
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95％。
[0007]所述冷冻保护剂为二甲亚砜、甘油中的一种或两种。
[0008]所述低温储存介质优选的组成为10％二甲亚砜和90％DMEM高糖培养基。
[0009]所述低温储存介质优选的组成为10％甘油和90％DMEM高糖培养基。
[0010]所述低温储存介质的制备方法为将冷冻保护剂和DMEM高糖培养基充分混合即得。
[0011]所述低温储存介质的降温程序为4℃冰箱孵育20min后，转入
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20℃冰箱冻存；或者4℃冰箱孵育20min后，转入
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20℃冰箱降温30min，最后放入
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80℃冰箱冻存。
[0012]所述低温储存介质中皮肤的解冻复温的方法为37℃恒温水浴箱中快速解冻，待全
部融化后，弃去离心管中的冻存液，加入DMEM高糖培养基，孵育3min后弃去，重复三次，用DMEM清洗后再用生理盐水清洗。
[0013]SD大鼠离体皮肤的制备方法，步骤如下：
[0014]取皮：取体重200
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220g的SD大鼠，按5mL/kg的剂量腹腔注射20％乌来糖溶液麻醉；固定于自制纸板上，使用宠物电推剪推去大鼠腹部毛发，再使用电动剃须刀轻缓地剃去细小绒毛；脱颈致死后，使用手术剪将去除毛发的腹部皮肤剪下。
[0015]去脂肪：将剪下的鼠皮铺展于滤纸上，角质层朝向纸面，使用图钉将鼠皮固定于纸面上；使用眼科弯镊与眼科弯剪将脂肪与鼠皮真皮层分离剪下，备用。
[0016]巴马香猪离体皮肤的制备方法，步骤如下：
[0017]一月半龄巴马香猪气体麻醉后，使用电推剪和剃须刀剃去猪毛，注射过量氯化钾溶液执行安乐死，使用手术刀将腹部、侧面及背部皮肤整块环切下来，清水冲洗皮肤外表面使用电动取皮机制得厚度约为0.8mm
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1mm的猪皮。
[0018]本专利技术的关键在于：
[0019]本领域皮肤冻存的主要因素为体外渗透性和皮肤活力这两个指标，特别是作为药物筛选，进一步要求长期冻存复苏后依然符合要求(如7天以上)其要求更加苛刻。本专利技术经过大量实验发现特定种类冷冻保护剂和对应比例的影响上述两个指标。具体而言：DMEM高糖培养基富含多种氨基酸和葡萄糖，可以满足离体皮肤对基础营养物质的要求，并且在
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20℃及
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80℃这样的低温下，皮肤细胞代谢速度也大幅减缓，从而可以将离体皮肤的活力维持在较高水平。二甲亚砜和甘油作为冷冻保护剂，能够减少冷冻时冰晶对细胞的损伤，以保护皮肤的细胞活力、形态和组织结构。然而高浓度的冷冻保护剂会造成不可避免的细胞毒性，故冷冻保护剂过低或过高都会降低冻存的皮肤的活力。
[0020]有益效果
[0021]本专利技术的优点在于低温储存介质通过冷冻保护剂的加入提高了皮肤活力。体外渗透实验表明，低温储存介质在保护皮肤的活力的同时，皮肤的通透性也得到了保护。本专利技术的配制方法简单，成本较低，有利于工业化生产。
附图说明
[0022]图1是实施例14、15的大鼠皮
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80℃下皮肤活力变化图，其中A为10％二甲亚砜，B为10％甘油；
[0023]图2是实施例16、17的猪皮
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80℃下皮肤活力变化图，其中A为10％二甲亚砜，B为10％甘油；
[0024]图3是实施例18、19的大鼠皮
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20℃下皮肤活力变化图，其中A为10％二甲亚砜，B为10％甘油；
[0025]图4是实施例20、21的猪皮
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20℃下皮肤活力变化图，其中A为10％二甲亚砜，B为10％甘油。
具体实施方式
[0026]以下通过具体实施例进一步说明本专利技术，但本专利技术并不限于下列实施例包含的内容。
[0027]人类皮肤对于基础研究难以获得，故本专利技术采用常用的大鼠皮和猪皮来替代人皮。Sprague
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Dawley(SD)大鼠皮和巴马香猪皮是目前体外渗透实验中使用最多的大鼠和猪皮肤模型。
[0028]实施例1SD大鼠离体皮肤的制备
[0029]取皮：取体重200
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220g的SD大鼠，按5mL/kg的剂量腹腔注射20％乌来糖溶液麻醉；固定于自制纸板上，使用宠物电推剪推去大鼠腹部毛发，再使用电动剃须刀轻缓地剃去细小绒毛；脱颈致死后，使用手术剪将去除毛发的腹部皮肤剪下。
[0030]去脂肪：将剪下的鼠皮铺展于滤纸上，角质层朝向纸面，使用图钉将鼠皮固定于纸面上；使用眼科弯镊与眼科弯剪将脂肪与鼠皮真皮层分离剪下，备用。
[0031]皮肤活力用皮片制备：使用直径为6mm的皮肤活检钻在处理好的大鼠皮上钻取皮片，称重记录。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种离体皮肤低温储存介质，其特征在于：含有二甲亚砜和DMEM高糖培养基；按体积比计，二甲亚砜占5％
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20％，DMEM高糖培养基占80％
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95％；或含有甘油和DMEM高糖培养基，按体积比计，其中甘油占5％
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20％，DMEM高糖培养基占80％
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95％；2.根据权利要求1所述的离体皮肤低温储存介质，其特征在于：按体积比计，二甲亚砜占10％，DMEM高糖培养基占90％；或甘油占10％，DMEM高糖培养基占90％；3.权利要求1或2所述的离体皮肤低温储存介质在SD大鼠和巴马香猪离体皮肤保存中的应用。4.一种离体皮肤低温储存的方法，其特征在于：将离体皮肤置于权利要求1或2所述的离体皮肤低温储存介质内，在4℃冰箱孵育20min后，转入
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20℃冰箱冻存；所述的离体皮肤为SD大鼠和巴马香猪离体皮肤。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：将离体皮肤置于权利要求1或2所述的离体皮肤低温储存介质内，在4℃冰箱孵育20min后，转入
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20℃冰箱降温30min，最后放入
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【专利技术属性】
技术研发人员：吕慧侠，凌佳伟，杜雅楠，盛雨泽，
申请(专利权)人：中国药科大学，
类型：发明
国别省市：