一种脂肪间充质干细胞的保存方法技术

本发明专利技术提供了一种脂肪间充质干细胞的保存方法，包括配置低温保存液，放置于冰水混合物中预冷，然后将收获的脂肪间充质干细胞用培养基溶液重悬，并放置于冰水混合物中，向重悬液中逐滴加入低温保存液，采用梯度降温法降温，速度为1℃

【技术实现步骤摘要】
一种脂肪间充质干细胞的保存方法


[0001]本专利技术属于干细胞的保存方法领域，尤其是涉及一种脂肪间充质干细胞的保存方法。

技术介绍

[0002]间充质干细胞在体内分布十分广泛，目前已成功从骨髓、肝、脐带血、胎盘、牙髓、脂肪组织等处分离培养出间充质干细胞。相较于骨髓间充质干细胞，脂肪间充质干细胞具有含量丰富、获取容易、免疫相容性好、干性维持能力强、致瘤性低等优点，被广泛的应用于再生医学。
[0003]脂肪间充质干细胞一般都是在液氮中保存数年，并在移植前快速解冻，但细胞在冻存的过程中会遭到渗透的压力及冰晶形成等的破坏，影响干细胞的活性和代谢。目前已批准的干细胞产品和临床上普遍采用的干细胞制剂多数为冻存制剂的形式，现已存在的冻存剂种类较多，常见的冻存剂的种类包括：二甲基亚砜(Dimethyl sulfoxide，DMSO)，聚乙烯吡咯啉酮(Polyvinyl Pyrrolidone，PVP)，海藻糖(Trehalose)，乙二醇(Ethylene Glycol，EG)，丙二醇(1,2
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Propanediol，PG)，甘油(GLYCEROL，G)，葡萄糖(Glucose)，蔗糖(Sucrose)，羟乙基淀粉(Hydroxyethyl Starch，HES)，b FGF，EGF(生长因子)，亚牛磺酸(Hypotaurine)，麦芽糖(Maltose)，甲基纤维素(MethylCellulose)，丝胶(Sericin)，抗氧化剂(Antioxidant)，抑制剂，左旋肉碱(L
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carnitine)等，研究显示，大多干细胞药物都添加了二甲基亚砜，但二甲基亚砜是一种有毒试剂，与蛋白质的疏水集团发生作用，可导致蛋白质变性。二甲基亚砜不能有效阻止细胞内冰晶的生成，反而减弱了对细胞的保护作用。但使用其他冻存保护剂，比如乙二醇、甲醇、聚合物羟乙基淀粉等，也不可避免地引起细胞损伤，研究一种起到有效低温保存作用的保护剂问题尚待解决。

技术实现思路

[0004]有鉴于此，本专利技术旨在提出一种脂肪间充质干细胞的保存方法，以解决现有技术中保存方法不当，导致范细胞复苏后细胞损伤大的问题。
[0005]为达到上述目的，本专利技术的技术方案是这样实现的：
[0006]一种脂肪间充质干细胞的保存方法，包含以下步骤：
[0007]1)配置低温保存液，放置于冰水混合物中预冷；
[0008]2)将收获的脂肪间充质干细胞用培养基溶液重悬，并放置于冰水混合物中；
[0009]3)向重悬液中逐滴加入低温保存液；
[0010]4)采用梯度降温法降温，速度为1℃
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2℃/min,降至
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80℃时，不再降温，存放过夜，然后转入液氮罐中保存。
[0011]进一步的，所述保存液含有10％
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20％DMSO，5％
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10％FBS，5％
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10％海藻糖。进一步的，步骤1)所述保存液含有10％DMSO，5％FBS，5％海藻糖。
[0012]进一步的，步骤2)所述培养基溶液含10％FBS，1％氯霉素的低糖DMEM培养基。
[0013]相对于现有技术，本专利技术所述的一种脂肪间充质干细胞的保存方法具有以下优势：
[0014](1)本专利技术所述的低温保存液能对脂肪间充质干细胞起到较强的保护作用，且配方制备方便，保存细胞的存活率较高。
[0015](2)本专利技术所述的保存方法能够降低脂肪间充质干细胞的冷冻损伤，降低细胞凋亡的发生比例。
[0016]在不加保护条件下直接冻存细胞时，细胞内和外环境中的水会形成冰晶，能导致细胞内发生一系列的变化，如机械损伤、电解质浓度升高、渗透压改变、脱水、pH值改变、蛋白质变性等，能引起细胞死亡.但如向培养基中加入保护剂(甘油或DMSO),可使冰点降低，在缓慢的冻存条件下,能使细胞内水分在冻结前透出细胞外。
[0017]二甲基亚砜(DMSO)存在一定的毒性，能够与蛋白质疏水基团发生作用，导致蛋白质变性，并具有一定的血管毒性和肝肾毒性。除此之外，作为有机溶剂，反应介质和有机合成中间体，DMSO也是一种渗透性性保护剂，能够降低细胞冰点，减少冰晶的形成，减轻自由基对细胞损害，改变生物膜对电解质，药物，毒物，和代谢产物的通透性。
[0018]海藻糖的添加能够对细胞冻存起保护作用，可显著提高冻存复苏后的细胞活性参数，提高过氧化氢酶的活性和超氧化酶的活性。减少ROS(氧化反应链)水平和MDA(丙二醛)浓度。海藻糖具有保护冻存损伤和抵抗抗氧化能力，还能够显著提高膜的完整性。
[0019]胎牛血清(FBS)是供维持细胞生长的激素，能促进所培养细胞的生长；FBS能弥补基础培养基中没有或含量很少的营养物质，提供结合蛋白，促进细胞识别和利用维生素、脂类和其他激素；FBS能促进细胞贴壁，提供可促进细胞铺展在塑料培养基质的因子；起酸碱度缓冲液作用；提供蛋白酶抑制剂，使细胞消化时残留的胰蛋白酶失活，保护细胞不受伤害。
具体实施方式
[0020]实施例1脂肪间充质干细胞的分离方法
[0021]提取大鼠腹股沟部位皮下脂肪组织，剪碎成肉糜状，加入等体积3mg/mLⅠ型胶原，37℃恒温消化30min，用含10％FBS,1％氯霉素的DMEM/F12培养基重悬后，200目细胞筛网过滤，接种于培养瓶中。置于37℃、5％ CO2培养箱中培养，每隔2
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3天换液1次，并在倒置显微镜下观察细胞生长情况，待细胞贴壁融合80％
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90％左右时，加入胰酶消化5
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10分钟，待细胞脱离瓶壁后，加入2倍体积培养基，以1000r/min离心5min，吸除上清，培养基重悬沉淀，用1:2比例进行传代培养，收获P2代的脂肪间充质干细胞，计算活细胞/死细胞的百分率。
[0022]实施例2.脂肪间充质干细胞低温保存方法
[0023](1)按照表1配制低温保存液；
[0024]表1低温保存液配方组分及比例
[0025][0026][0027](2)取对数生长期的细胞，去除旧培养基，用PBS清洗；
[0028](3)去除PBS，加入适量胰蛋白酶(覆盖培养皿表面)把单层生长的细胞消化下来，在1500rpm，离心5min；
[0029](4)去除胰蛋白酶，加入适量配制好的冻存培养液，用吸管轻轻吹打，混匀，计数，调节冻存液中细胞的最终密度。一般为5x106或1x107个/mL；
[0030](5)采用梯度降温法降温，速度为1℃
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2℃/min,降至
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80℃时，存放过夜，然后转入液氮罐中保存。
[0031]实施例3.脂肪间充质干细胞复苏和检测
[0032]细胞复苏后，分别对添加不同保存液细胞活性进行检测，分析不同低温保存剂冻存复苏后的细胞活性。
[0033]CCK
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8检测步骤：
[0034](1)向各本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种脂肪间充质干细胞的保存方法，其特征在于：包含以下步骤：1)配置低温保存液，放置于冰水混合物中预冷；2)将收获的脂肪间充质干细胞用培养基溶液重悬，并放置于冰水混合物中；3)向重悬液中逐滴加入低温保存液；4)采用梯度降温法降温，速度为1℃
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2℃/min,降至
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80℃时，不再降温，存放过夜，然后转入液氮罐中保存。2.根据权利要求1所述的脂肪间充质干细胞的保存方法，其特征在于，步骤...

【专利技术属性】
技术研发人员：宋芸娟，
申请(专利权)人：宋芸娟，
类型：发明
国别省市：