一种GDP-L-岩藻糖高产菌株的构建方法和应用技术

本发明专利技术涉及一种GDP

【技术实现步骤摘要】
一种GDP
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L
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岩藻糖高产菌株的构建方法和应用


[0001]本专利技术涉及一种GDP
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岩藻糖高产菌株的构建方法和应用，属于生物工程


技术介绍

[0002]GDP
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岩藻糖(guanosine 5'
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diphosphate(GDP)
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fucose)作为一种核苷酸糖，是生物体内进行岩藻糖基化修饰的重要糖基供体。此外，GDP
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岩藻糖是合成人乳寡糖的重要中间体，在利用微生物代谢合成岩藻糖基化人乳寡糖(Humanmilk oligosaccharidesHMOs)的生物过程中发挥关键作用。GDP
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岩藻糖可以通过化学合成、酶法合成和微生物细胞代谢法生产。与化学合成和酶法合成相比，微生物代谢合成具有经济、高效、环保、周期短和可控性强等诸多优势。因此，利用代谢工程策略构建重组菌株高效合成GDP
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岩藻糖，对生产岩藻糖基化合物，尤其是岩藻糖基化的人乳寡糖具有重要意义。
[0003]大肠杆菌由于生长迅速、培养简单、重组子稳定、载体受体系统完备等特点，是作为GDP
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岩藻糖合成研究的理想模式微生物，而大肠杆菌自身也存在从头合成GDP
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岩藻糖的代谢通路。现有合成GDP
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岩藻糖的代谢方式大多使用质粒，即先将目的基因整合进大肠杆菌的表达质粒，然后通过诱导使目的基因参与合成代谢。然而质粒表达系统有某些缺陷，比如在长期培养中倾向于扩增质粒拷贝数，随着时间推移质粒丢失；另外质粒一般含有各种抗生素，抗生素的使用一方面会增加培养成本，另一方面则会使合成产物的纯化与质量控制带来额外的影响。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于解决上述
技术介绍
部分的不足，提供一种GDP
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岩藻糖高产菌株的构建方法。
[0005]技术方案
[0006]研究发现，大肠杆菌中甘露糖
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磷酸鸟嘌呤基转移酶manB和磷酸甘露糖变位酶manC参与合成GDP
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甘露糖，紧接着GDP
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甘露糖通过GDP
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甘露糖脱水酶gmd，差向异构和还原双功能酶WcaG(fcl基因)转化为GDP
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岩藻糖。然而在整个代谢通路中GDP
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甘露糖基水解酶gmm和可拉酸生物合成岩藻糖基转移酶wcaI基因与GDP
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岩藻糖合成基因位于同一位置，其中gmm基因能够水解GDP
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甘露糖，wcaI基因被参与了岩藻糖分子的转运以及可拉酸的合成。从此通路可得到结论：提高GDP
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甘露糖的含量，减少可拉酸的合成可以提高胞内的GDP
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岩藻糖含量。由于大肠杆菌内的manB和manC主要负责合成GDP
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甘露糖，本研究通过对分解GDP
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甘露糖的基因gmm以及参与可拉酸合成的wcaI进行敲除，并在敲除区域添加较强的RBS过表达甘露糖
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磷酸鸟嘌呤基转移酶manB基因和磷酸甘露糖变位酶manC基因，从而提高GDP
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岩藻糖产量。具体方案如下：
[0007]一种GDP
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岩藻糖高产菌株的构建方法：以大肠杆菌为出发菌株，敲除GDP
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甘露糖基水解酶gmm和可拉酸生物合成岩藻糖基转移酶wcaI基因，并在敲除区域添加核糖体结
合位点来过表达甘露糖
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磷酸鸟嘌呤基转移酶manB基因和磷酸甘露糖变位酶manC基因，得到GDP
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岩藻糖高产菌株；所述甘露糖
‑1‑
磷酸鸟嘌呤基转移酶manB基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述磷酸甘露糖变位酶manC基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
[0008]进一步，所述出发菌株为大肠杆菌BL21、JM109、JM109(DE3)、BL21(DE3)、K12或MG1655。
[0009]进一步，所述敲除GDP
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甘露糖基水解酶gmm和可拉酸生物合成岩藻糖基转移酶wcaI基因是通过采用CRISPR
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Cas9基因编辑方法来实现。
[0010]进一步，所述核糖体结合位点选自BBa_B0034、BBa_B0030或BBa_B0032，BBa_B0034、BBa_B0030和BBa_B0032的编码序列分别如SEQ ID No.3、SEQ ID No.4和SEQ ID No.5所示；所述核糖体结合位点更优选为BBa_B0034。
[0011]一种采用上述构建方法得到的GDP
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岩藻糖高产菌株。
[0012]所述GDP
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岩藻糖高产菌株在发酵生产GDP
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岩藻糖中的应用。
[0013]本专利技术的有益效果：
[0014]本专利技术以模式菌株E.coli为出发菌株，将宿主内GDP
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岩藻糖的竞争代谢旁路基因gmm
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wcaI敲除，并在敲除区域添加核糖体结合位点用来过表达参与合成GDP
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甘露糖的甘露糖
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磷酸鸟嘌呤基转移酶manB和磷酸甘露糖变位酶manC，运用了组合模块化代谢工程和辅因子工程策略来改造菌株，强化了菌株GDP
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岩藻糖的合成途径。结果显示，通过敲除产物竞争代谢通路，调高基因的表达水平，对比于现有技术其他的方法更有利于产物GDP
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岩藻糖的产量的提高。
附图说明
[0015]图1为实施例1构建的目标质粒337的质粒图。
具体实施方式
[0016]下面结合附图和具体实施例对本专利技术的技术方案作进一步说明。
[0017]需要说明的是，下述实施例中，所用到的实验技术与实验方法，如无特别说明，均为本领域常规技术方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可通过正规商业渠道获得。
[0018]①
下述实施例中所用的菌株及质粒：本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种GDP
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岩藻糖高产菌株的构建方法，其特征在于，以大肠杆菌为出发菌株，敲除GDP
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甘露糖基水解酶gmm和可拉酸生物合成岩藻糖基转移酶wcaI基因，并在敲除区域添加核糖体结合位点来过表达甘露糖
‑1‑
磷酸鸟嘌呤基转移酶manB基因和磷酸甘露糖变位酶manC基因，得到GDP
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L
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岩藻糖高产菌株；所述甘露糖
‑1‑
磷酸鸟嘌呤基转移酶manB基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述磷酸甘露糖变位酶manC基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。2.如权利要求1所述GDP
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岩藻糖高产菌株的构建方法，其特征在于，所述出发菌株为大肠杆菌BL21、JM109、JM109(DE3)、BL21(DE3)、K12或MG1655。3.如权利要求1所述GDP
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【专利技术属性】
技术研发人员：刘振云，化宿南，程丰伟，
申请(专利权)人：苏州一兮生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：